实验项目十四 DEAE－纤维素离子交换层析法分离血清蛋白质
学习目标
【知识目标】
（1）能用自己的语言描述离子交换层析法的原理。
（2）能够迅速而准确地陈述离子交换层析法的实验操作要点。
（3）能够准确鉴别离子交换层析法的结果，并能说明其意义。
【能力目标】
（1）能够正确完成离子交换层析法的各项操作内容，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。
（2）能够正确操作离子交换层析，并清楚有哪些注意事项。
（3）能够正确分析离子交换层析的结果。
案例引导
糖化血红蛋白（HbA1c）是血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物，能够反映一段时间内受试者的血糖控制情况，因此它可以作为糖尿病检测诊断中的一个指标。我国的糖化血红蛋白控制标准为6.5%以下，如果糖尿病患者的糖化血红蛋白控制标准高于6.5%，那么就要加强血糖的控制，调整治疗方案。运用所学知识，思考如何从血液中分离检测糖化血红蛋白。
（提示：离子交换层析法）
【实验原理】
根据离子交换层析柱上具有可解离的酸性基团和碱性基团将交换剂分为阳离子交换剂（交换基团带负电荷，能结合阳离子）和阴离子交换剂（交换基团带正电荷，可结合阴离子）。本实验采用的是弱碱性阴离子交换剂DEAE－纤维素（二乙基胺乙基纤维素），它的功能基团为
DEAE－纤维素一般在pH＜8.6的条件下应用，适用于中性蛋白质和酸性蛋白质的分离，常用来分离血清蛋白质。在本实验条件下，血清蛋白质与DEAE－纤维素的结合力主要受蛋白质分子带电荷量多少的影响，即带电荷量越多，与离子交换剂结合力越强。在pH＞7时，血清中各种蛋白质所带电荷量由多至少依次为清蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白。当降低缓冲洗脱液pH值并增加离子强度进行洗脱时，待分离的血清蛋白质逐步被洗脱下来。其次序为γ－球蛋白、β－球蛋白、α－球蛋白、清蛋白。
【实验器材】
核酸蛋白检测仪，记录仪，20cm×1cm层析柱，部分收集器，梯度混合器。
【药品及试剂】
DEAE－纤维素，0.5mol/L HCl，0.5mol/L NaOH，0.01mol/L Na2HPO4，0.5 mol/L NaH2PO4。
操作流程
【操作步骤】
1.DEAE－纤维素的处理
称取DEAE－纤维素约2.5g，轻撒在盛有40mL 0.5mol/L HCl溶液的100mL量筒的液面上，轻轻振摇，使纤维素缓慢下沉，浸泡30min，然后加蒸馏水至100mL，用玻璃棒搅拌。静置10min，倒去上清液，重复加水，静置后再倾去上清液，反复2～3次，使上清液中不含微细混悬物，然后倒入有尼龙滤布（必要时加一层滤纸）的漏斗中，加水充分洗涤，直到流出液的pH值不小于4（用pH试纸检查）。
将上述处理的纤维素放入250mL的烧杯中，加0.5mol/L NaOH 40mL，浸泡30min，加蒸馏水至100mL，搅拌后倒入含有尼龙细布的漏斗中，用水充分洗涤，直到流出液的pH值不大于8，然后将用碱处理过的上述纤维素置于250mL的烧杯中，加100mL 0.01mol/L Na2HPO4搅拌，放置5min，倒去上清液，再加0.01mol/L Na2HPO4100mL，反复几次，直到pH值为8。
2.装柱
将层析柱垂直固定好，下端的出水管用螺旋夹夹紧，然后将处理好的纤维素混悬液倒入管内，再放松螺旋夹使液体流出，直至纤维素全部加入柱中，且注意液面接近柱床时再将螺旋夹夹紧（注意：装柱要均匀，每次加的纤维素之间不要分层，中间不要含有气泡）。最后可在柱床上端放入一个圆形滤纸片。
3.加样
用吸量管小心地在层析柱内接近纤维素柱床上缓慢加入血清0.5mL，打开螺旋夹使液体缓慢流出（流速为5～10滴/分）。当全部血清进入柱床，立刻用滴管加入0.5mL 0.01mol/L Na2HPO4。液面接近柱床时，夹紧螺旋夹，将层析柱下面的橡皮管接到核酸蛋白检测仪的进样口，核酸蛋白检测仪的出样口接部分收集器，选择波长为280nm。
4.洗脱及检测
关闭梯度混合器的混合阀门和输出阀门，在输出口的一端杯内加入0.01mol/L Na2HPO4200mL，在另一端杯内加入0.5mol/L NaH2PO4200mL。将梯度混合器放置于高出层析柱30～50cm处，连接梯度混合器和层析柱，接通电源，调节搅拌混合速度，打开输出阀门和混合阀门及层析柱下端的螺旋夹，调节层析洗脱液的流速（5～7滴/分），收集洗脱液。
【实验数据处理及结果分析】
通过核酸蛋白检测仪和记录仪绘出分离曲线峰值，找到对应收集管，即得到分离蛋白质溶液。
【注意事项】
（1）在层析过程中洗脱不宜太快，应控制在5～7滴/分。
（2）层析柱柱床上的洗脱液不能堆积。
（3）加样时，不要搅起柱床的纤维素。
【实验意义】
吸附层析法在医药领域有很广泛的应用，特别是在中医药成分的分离分析上，有重要的作用。
能力检测
一、单项选择题
1.在pH＞7时，血清中各种蛋白质所带电荷量由多至少依次为（ ）。
A.β－球蛋白、γ－球蛋白、α－球蛋白、清蛋白
B.清蛋白、γ－球蛋白、β－球蛋白、α－球蛋白
C.清蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白
D.清蛋白、α－球蛋白、γ－球蛋白、β－球蛋白
E.清蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白、α－球蛋白
2.关于血清蛋白质的下列叙述哪项是错误的？（ ）
A.血清总蛋白参考范围为60～80g/L
B.清蛋白参考范围为35～50g/L
C.肾病综合征时清蛋白与球蛋白比值降低
D.肝硬化时清蛋白与球蛋白比值升高
E.严重脱水时，清蛋白与球蛋白比值不变
3.下列有关血液的叙述，错误的是（ ）。
A.血浆约占血液总量的55%
B.血细胞包括红细胞、白细胞、血小板
C.血液在体外后可自行凝固
D.造血系统的疾患可通过血液影响全身
E.血液检验只用于各种血液系统疾病
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