实验17 免疫印迹技术
(Immunoblotting)
【目的】
了解并掌握免疫印迹实验的原理、方法及主要用途。
【原理】
免疫印迹或免疫转印技术(immunoblotting或Western blot)是在Southern(1975)创建的DNA印迹术(Southern blotting)基础上发展起来的一种新型免疫生化技术。其基本原理是蛋白质样品经过SDS-PAGE分离后，通过转移电泳或直接印迹方式原位转印至固相介质上，并保持其原有的物质类型和生物学活性不变，然后应用抗原-抗体反应进行特异性检测。
免疫印迹技术包括三个主要部分:①蛋白质的分离;②蛋白质的转移;将已分离的蛋白多肽转移至固相介质上;③免疫学检测，应用抗原-抗体反应对样品进行特异性分析鉴定。
一、蛋白质的分离
十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将强阴离子去污剂SDS与二巯基乙醇并用，通过加热使蛋白质解离变性，变性的多肽与SDS结合并因此带负电荷，由于与肽结合SDS的量几乎与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此，SDS多肽复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可结合1.4g去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽的分子量。
二、蛋白质转移电泳
转移电泳是将经过SDS-PAGE分离后的蛋白多肽带原位、精确地转印至固相介质如NC膜，并保持其原有物质类型和生物学活性，以利于进一步分析与鉴定。由于转移的蛋白分子多位于固相膜的表面，因此检测十分简便，可进行一些在凝胶上难以甚至不可能进行的试验，以取得定位、定性和定量等直观资料。转移电泳使用低压大电流电泳仪，因此电泳过程需在低温条件下(4～6℃)进行。
三、免疫学检测
免疫印迹技术的主要特点是可以利用抗原-抗体反应对检品进行特异组分的分析和鉴定。常用的固相免疫检测法有放射自显影法、酶免疫测定法(EIA)及免疫荧光法(FIA)等。其中以酶免疫测定法应用较广，因其灵敏、快速、简便易行。目前大多采用酶标记抗体间接染色法，其大致步骤是将转印后的NC膜先与第一抗体共育，洗涤后，再与酶标记的第二抗体(抗抗体)共育，洗涤后，浸于底物溶液中显色。
【材料】
1.试剂: 30％丙烯酰胺储存液、1.5mol/L pH 8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液、0.5mol/L pH 6.8 Tris-HCl浓缩胶缓冲液、四甲基乙二胺、10％过硫酸铵溶液、0.025mol/L pH 8.3 Tris-甘氨酸电泳缓冲液、转移缓冲液、洗涤缓冲液、溴酚蓝、考马斯亮蓝、冰醋酸、甲醇、牛血清白蛋白、底物缓冲液。
2.仪器:电泳仪、垂直电泳槽、转移电泳槽、NC膜。
【方法】
1.制胶:将洗涤干净的模具装好，检查有无渗漏，按需要的浓度(表17-1和表17-2)制备分离胶和浓缩胶，先将分离胶注入模具，待其凝聚后再浇入浓缩胶。
表17-1 10％分离胶制备
表17-2 5％浓缩胶制备
2.样品处理:将样品经样品处理液适当稀释，沸水加热2～3min，加样量一般每个样品池10～40μl。
3.电泳:下槽正极，上槽负极，起始电流10mA/板，待样品全部进入浓缩胶后增大到20mA/板，待指示剂到达凝胶底部，结束电泳。
4.凝胶染色: 0.2％考马斯亮蓝染色3～4h，用脱色液脱色至背景清晰为止。
5.转移电泳:凝胶电泳结束前30min，将NC膜浸泡在转移缓冲液中。从模具中取出凝胶放在NC膜上，驱除气泡，然后置于滤纸上并放入转移模具中，将模具放入转移电泳槽，NC膜一面朝正极，恒压50V，4℃电泳过夜，次日取出NC膜做好标记，用洗涤缓冲液洗涤10min，共3次，自然干燥，密封保存。
6.抗原-抗体特异性检测。
将NC膜置封闭液中阻断非特异性结合部位后，与一抗37℃保温1h，洗涤10min，共3次，再加入酶标记的二抗，37℃1h，洗涤同前，加入底物溶液显色5～15min，蒸馏水反复洗涤，终止反应。
【结果】
阳性反应呈棕色条带。
【思考题】
试述免疫印迹技术的原理和主要操作步骤。
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