一、目的要求
1．掌握盐析法分离酶的基本原理和操作。
2．掌握结晶的基本方法和操作。
3．学习胰凝乳蛋白酶制备的方法。
二、实验原理
蛋白质分子表面带有一定的电荷，因同种电荷相互排斥，使蛋白质分子彼此分离；同时，蛋白质分子表面分布着各种亲水基团，这些基团与水分子相互作用形成水化膜，增加蛋白质水溶液的稳定性。如果在蛋白质溶液中加入大量中性盐，蛋白质分子表面的电荷被大量中和，水化膜被破坏，于是蛋白质分子相互聚集而沉淀析出，这种现象称为盐析。由于不同的蛋白质分子表面所带的电荷多少不同，分布情况也不一样，因此不同的蛋白质盐析所需的盐浓度也各异。盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合液中的各个成分分步析出，达到粗分离蛋白质的目的。
三、仪器与试剂
1．仪器
冷冻离心机（图3-6-1）、高速组织捣碎机、解剖刀、烧杯、透析袋、分析天平等。
2．样品及试剂
新鲜猪胰脏、H2SO4、固体（NH4）2SO4、Na OH、Ba Cl2等。
图3-6-1 冷冻离心机
四、实验操作与步骤
（1）提取过程：取新鲜猪胰脏，放在盛有冰冷0.125 mol/L H2SO4的容器中，保存在冰箱中待用。去除胰脏表面的脂肪和结缔组织后称重。用组织捣碎机绞碎，然后涽悬于 2 倍体积的冰冷0.125 mol/L H2SO4溶液中，放冰箱内过夜。将上述混悬液离心10 min，上层液经2层纱布过滤至烧杯中，将沉淀再混悬于等体积的冰冷的0.125 mol/L H2SO4溶液中，再离心，将两次上层液合并，即为提取液。
（2）分离过程：取提取液10 m L，加1.14 g固体（NH4）2SO4，放置10 min，离心（3 000 r/min）10 min，弃去沉淀，保留上清液。在上清液中加入1.323 g固体（NH4）2SO4，放置10 min离心10 min，弃去上清液，保留沉淀。将沉淀溶解于3倍体积的水中，装入透析袋中，用p H值为7.4的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液透析，直至1%Ba Cl2检查无白色Ba SO4沉淀产生，然后离心5 min，弃去沉淀（变性的酶蛋白），保留上清液。在上清液中加（NH4）2SO4（0.39 g/m L），放置10 min，离心10 min，弃去上清液，保留沉淀（即为胰凝乳蛋白酶）。
（3）结晶过程：取分离所得的胰凝乳蛋白酶容于3倍体积的水中，然后加（NH4）2SO4 （1.14 g/m L）至胰凝乳蛋白酶溶液，用 0.1 mol/L 的 Na OH 调节 p H 值至 6.0，在室温下（25℃～ 30℃）放置12 h即可出现结晶。
（4）干燥：5 000 r/min离心10 min结晶液，去除上清，放置冷冻干燥器中干燥，称重。
五、实验说明
（1）整个操作过程在0℃～5℃条件下进行。
（2）胰凝乳蛋白酶的结晶形态与制备工艺有一定的相关性。
六、思考题
1．什么是分步盐析法？
2．计算胰凝乳蛋白酶的得率，并分析影响胰凝乳蛋白酶得率的因素。
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