淋巴细胞亚群的检测

    实验26　T淋巴细胞亚群的检测

    (Detection of T-lymphocyte subsets)

    【目的】

    了解T淋巴细胞亚群的检测方法、结果判断及其实际意义。

    【原理】

    各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞的检测即是用体外试验对机体各种参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞进行分离、纯化鉴定、计数和功能测定，借以了解机体的免疫状态，其对某些临床疾病的诊断、疗效观察及预后判断等也有一定意义。

    【材料】

    1.肝素抗凝的新鲜外周血标本，肝素100～125μl/ml。

    2.淋巴细胞分离液，比重1.077±0.01。

    3.单克隆抗体CD₃、CD₄、CD₈(第一抗体)。

    4.异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG抗体(第二抗体)。

    5.含5％新生牛血清的Hanks液。

    6.小试管、毛细吸管、载玻片、盖玻片、水平离心机、大离心机。7.荧光显微镜、细胞计数器。

    【方法】

    1.取1×10⁷/ml细胞20μl加入4支微孔板小孔内，将1∶50稀释的抗CD₃、抗CD₄、抗CD₈各取20μl，分别加入微孔板孔内，对照加入20μl的Hanks液，混匀后置40℃冰箱45min。

    2.于微孔板内加入2m l含有5％小牛血清的Hanks液，混匀，离心沉淀(2000r/min×5min)。

    3.倾弃上清液，再洗涤离心一次。

    4.倾弃上清液，用毛细吸管吸取细胞悬液滴加于载玻片上，覆以盖玻片，置荧光显微镜下观察。

    【结果】

    在荧光显微镜下可见到细胞膜周呈环状或斑点状黄绿色明亮荧光的淋巴细胞，即为荧光阳性T细胞，每份标本至少计数200个淋巴细胞(包括不发荧光的淋巴细胞)，计算出T细胞的百分率。外周血T细胞亚群的正常值为:

    

    【注意事项】

    1.如果分离的细胞中有大量红细胞，则要用Tris-NH₄Cl破红细胞后再计数。

    2.分离的淋巴细胞放置不能超过12h，否则细胞活性会降低或细胞会自然死亡，影响结果。

    【思考题】

    1.T细胞有哪些亚群?

    2.T细胞亚群各有什么功能?