生物素－亲和素标记技术

由 范文之家 分享时间：2023-10-16 20:32:04 加入收藏我要投稿点赞

生物素－亲和素标记技术

单元四　生物素－亲和素标记技术

单元学习目标

1.掌握生物素－亲和素放大系统在检验中的应用。

2.熟悉生物素－亲和素放大系统的特点。

3.了解生物素、亲和素、链霉亲和素的理化性质和标记技术。

生物素－亲和素系统（biotin－avavidin　system，BAS）是20世纪70年代后期应用于免疫学的一种新型生物反应放大系统，已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域。

一、生物素的理化性质与标记

（一）理化性质

生物素（biotin，B）又称维生素H或辅酶R，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，相对分子质量244.31。分子式为C₁₀H₁₆O₃N₂S，是一种白色结晶化合物。正常成人血中生物素含量为12～14μg/mL。生物素分子结构中的咪唑酮环，是与亲和素或链霉亲和素（SA）结合的主要部位，而四氢噻唑吩环是与蛋白质（酶和抗体）结合的唯一结构。生物素与SA的结合力比抗原抗体之间的结合力要高1万倍，二者一旦结合，其复合物十分稳定，不易解离。

（二）活化生物素

在免疫学检验中，一般需将生物素进行化学修饰（生物素活化）后才能与蛋白质（酶、抗体、抗原）或核酸结合。利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。活化生物素易与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。下面介绍几种修饰后生物素衍生物（活化生物素）及其特性。

1.标记蛋白质氨基的活化生物素

生物素N－羟基丁二酰亚胺酯（biotin－N－hydroxy succinimide ester，BNHS）是将生物素与N－羧基丁二酰亚胺在碳二亚胺的作用下进行缩合生成的一种活化生物素。BNHS分子酯键中的─C═O基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键，从而使蛋白质标记上生物素。若蛋白质含赖氨酸残基多，且等电点pI＞6时，标记效果好。因此，BNHS适用于对抗体和中性或偏碱性抗原的生物素标记。

生物素的相对分子质量较小，当与抗体或酶反应形成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的空间位阻效应，可对生物素与亲和素的结合以及BAS的应用效果造成干扰。如用长臂活化生物素（BCNHS）可通过在生物素分子侧链上连接一定数量的基团（如6－氨基己糖分子基团），形成交联臂，增加生物素与被标记大分子间的距离，减少位阻效应。

2.标记蛋白质醛基、巯基的活化生物素

生物素酰肼（biotin hydrazide，BHZ）是水合肼与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。肼化生物胞素（biocytin hydrazide，BCHZ）是生物素通过C═O基团与赖氨酸的ε－氨基连接而成的化合物，它除可与蛋白质的醛基结合外，也能与蛋白质的氨基结合，因此其适用范围较BHZ宽。3－（N－马来酰亚胺－丙酰）－生物胞素（MPB）能特异性地与蛋白质巯基结合成活化生物素试剂。

3.标记核酸的活化生物素

活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。常用于标记核酸分子的活化生物素有光敏生物素、生物素脱氧核苷三磷酸（Bio－11－dUTP）、BNHS和BHZ等，目前常用光敏生物素和生物素化dUTP作为标记核酸的活化生物素。

（三）生物素标记蛋白质

生物素标记蛋白质即是将活化的生物素与各种蛋白质结合的过程，又称生物素化。

1.活化生物素的标记

（1）标记抗体、抗原　常用于标记抗体的活化生物素是BNHS。反应时，BNHS分子中的酯键在碱性溶液中迅速水解，─C═O基团即可与抗体蛋白质中的赖氨酸残基形成肽键，使生物素标记在抗体分子上。游离生物素只需简单的透析方法即可除去。

BNHS也可标记中性或偏碱性的抗原，对于分子偏酸性的抗原，标记时多采用BHZ。

（2）标记酶　以生物素标记辣根过氧化物酶（HRP）为例，将含有BNHS的N，N′－二甲基甲酰胺溶液滴加入HRP碳酸盐缓冲液中（0.1mol/L，pH值为8.4），使最终两种反应物混合体积比为1∶8，充分反应后用PBS透析2天除去未标记生物素等物质，即得到生物素化HRP。

2.标记注意事项

（1）应根据抗原或抗体分子结构中可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的理化性质（酸性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。

（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。如标记抗体时，IgG的应用浓度为0.5～5μg/mL，生物素与IgG的质量比为2∶1时，效果较好。一般每个抗原或抗体分子标记1～3或3～5个生物素分子较为适宜。

（3）为减少生物素标记蛋白质后，大分子物质造成的空间位阻影响，有利于生物素与亲和素的结合，可在生物素与被标记物间加入交联臂样结构。

（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同，HRP、葡萄糖氧化酶和β^－半乳糖苷酶，酶活性不受偶联生物素的干扰，但某些酶（如碱性磷酸酶）在标记生物素后，其活性会有一定程度降低。

二、亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记

亲和素（avidin，AV）和链霉亲和素（streptavidin，SA）是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白质，几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素（AV）或链霉亲和素（SA）结合。因此，上述特性是建立生物素－亲和素（链霉亲和素）放大技术的重要基础。

（一）亲和素及其活性

亲和素（AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，相对分子质量为68kD，等电点pI＝10.5。亲和素耐热并耐受多种蛋白质水解酶的作用，在纯水中的溶解度类似于球蛋白，而在50%硫酸铵溶液中的溶解度又与白蛋白相似。亲和素能结合4个分子的生物素，与生物素之间的亲和力极强，比抗原与抗体间的亲和力至少高1万倍，且特异性高、稳定性好。亲和素富含的色氨酸残基是与生物素咪唑环结合的基团。

（二）链霉亲和素及其活性

链霉亲和素（SA）是由链霉菌分泌的一种蛋白质，相对分子质量为65kD，是由4条相同肽链组成的稍偏酸性（pI＝6.0）的蛋白质，分子中不带任何糖基，故用于免疫组化、ELISA、核酸杂交等试验时非特异性反应低，优于亲和素。一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子。在蛋白质水解酶作用下，链霉亲和素可在N端或C端某些肽键间断裂，但仍保持结合生物素的能力。SA在4～42℃2周内保持活性，80℃时10min即丧失活性。

（三）亲和素（或链霉亲和素）的标记

用于标记亲和素或链霉亲和素的小分子示踪物有125I、胶体金、荧光素和化学发光物，大分子物质如酶、抗原或抗体、铁蛋白和荧光蛋白等，其中最常用的是酶、异硫氰酸荧光素（FITC）和胶体金。亲和素或链霉亲和素可直接与酶结合进行标记，还可以通过与生物素－酶复合物中的生物素结合，间接地与酶形成结合物（亲和素－生物素－酶）。

1.链霉亲和素的标记

链霉亲和素（SA）因表面所带正电荷少，且不含糖基，在实验中的非特异性结合远低于亲和素，因此目前以链霉亲和素标记的酶结合物更为常用。常有以下两种形式。

1）链霉亲和素（SA）直接标记酶形成SA－酶复合物

（1）HRP－SA结合物的制备　采用过碘酸钠法直接标记：新配制的HRP溶液中加入过碘酸钠，然后直接加入链霉亲和素溶液混匀，再用碳酸盐缓冲液（pH＝9.0）透析后，用硼氢化钾（KBH4）终止反应；加饱和硫酸铵沉淀，离心后弃上清液，再用PBS复溶沉淀即得HRP－SA结合物。

（2）AP－SA结合物的制备　采用戊二醛两步法标记：先用饱和硫酸铵沉淀碱性磷酸酶（AP），离心后加过量戊二醛溶液使其复溶，戊二醛的一个醛基即与碱性磷酸酶的氨基结合，充分透析除去未结合戊二醛后，再加链霉亲和素与结合了碱性磷酸酶的戊二醛的另一个醛基结合，用赖氨酸终止反应，离心后留取含AP－SA结合物上清液备用。

2）SA标记生物素化酶形成SA－生物素化酶复合物

如SA标记生物素化HRP的制备，先按BNHS标记抗体法进行生物素化HRP形成HRP－B，再将HRP－B进行适当稀释后，加入等体积的链霉亲和素溶液反应，即可制得SA－生物素化酶复合物（streptavidin－biotin－peroxidase complex，SABC）。

2.亲和素的标记

（1）HRP－亲和素结合物的制备　可以采用改良过的碘酸钠法或戊二醛法，方法步骤与HRP－链霉亲和素结合物的制备相似。

（2）亲和素－生物素化HRP复合物的制备　将亲和素与等体积的生物素化酶（HRPB）按一定浓度比例混合反应后，亲和素即与HRP－B中的生物素结合，形成亲和素－生物素化HRP复合物（ABC）。制备时应注意控制亲和素和HRP－B的浓度不高于40μg/mL和10μg/mL，否则将增加非特异性反应。

三、生物素－亲和素标记技术的应用

（一）生物素－亲和素（链霉亲和素）系统的特点

1.多级放大，灵敏度高　生物素与蛋白质和核酸类等生物大分子结合形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比活度高，具有多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，BAS具有多极放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。

2.亲和力高，特异性强　亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高稀释度而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异性作用。

3.稳定性高、不可逆结合　亲和素与生物素间的亲和常数比抗原－抗体反应至少高1万倍，二者结合形成的复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性，而且酸、碱、变性剂、蛋白质溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。

4.易于偶联，用途多样化　亲和素与生物素均可制成多种衍生物，具有偶联生物大分子和连接标记材料的特性，不仅可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合，用于定性、定量检测体液、组织或细胞中的微量抗原、抗体及受体的定位观察研究，也可制成亲和介质，分离和纯化抗原－抗体、激素－受体和核酸系统以及其他多种生物学反应体系中的反应物。

5.成本低，适用性广　一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具有通用性，适用于不同的反应体系；而且可高度稀释，尤其是BAS与成本高昂的抗体偶联使用，可使抗体的用量大幅度减少，成本降低。

6.检测快速，操作简便　由于生物素与亲和素的结合具高速、高效的特性，尽管BAS的反应层次较多，但所需的温育时间不长，实验往往只需数小时即可完成。

（二）生物素－亲和素系统的应用

由于BAS具有生物素与亲和素之间高度亲和力及多级放大效应等特点，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度得到提高，因而被广泛应用在各种标记免疫分析领域中，尤其在标记免疫检测自动化分析、核酸探针标记、细胞和生物活性物质分离提纯等方面也显示了明显的优越性。

1.生物素－亲和素系统基本原理及类型

BAS在应用中的基本类型有两种：一种以游离亲和素为桥联剂进行检测，如BAB法、ABC法；另一种是直接用标记亲和素为桥联剂进行检测，如BA法或LAB法。此外，依据待检反应体系中所用的是生物素化抗体或生物素第二抗体，又分为直接法BAS和间接法BAS。为最大限度避免待检标本中内源性生物素对引入BAS的检测方法的干扰，近年来也有依据BAS的基本工作原理，衍生出采用抗生物素抗体或抗亲和素抗体建立相应的BAS。

（1）BAB法　BAB法（biotin－avidin bind，BAB）也称桥联亲和素－标记生物素法，是以游离的亲和素作为桥联剂，利用亲和素的多价性，将检测反应体系中抗原－生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来，形成Ag—Ab－生物素—亲和素—生物素＊，达到检测反应分子的目的（图9－10）。由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗原－生物素化抗体－亲和素－酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子，加入相应酶作用底物后，即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。间接BAB法则是在抗原与特异性抗体结合反应后，再用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合，使反应增加一个层次，从而使灵敏度进一步提高。

图9－10　BAB法检测示意图

（2）ABC法　ABC法（avidin－biotin－peroxidase complex，ABC）是在BAB法基础上的改良，其原理是预先按一定比例将亲和素与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素－生物素－过氧化物酶复合物（亲和素－生物素－酶）（图9－11）。当其与检测反应体系中的生物素化抗体或生物素化第二抗体相遇时，ABC中未饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合（Ag—Ab－生物素—亲和素－生物素－酶），使抗原－抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。由于在ABC形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过其生物素连接多个亲和素，而一个亲和素分子又可桥联多个酶标生物素分子，经过这种依次的相互作用连接，从而形成一种较大的、具多级放大作用的网状结构，其中网络了大量酶分子。因此，将ABC复合体应用于免疫检测体系时，即可极大地提高酶在抗原－抗体反应场所的浓度，使该法的检测敏感性明显提高。

图9－11　ABC法检测示意图

（3）BA法　BA法或称标记亲和素－生物素法（labeled avidin－biotin，LAB），是以标记亲和素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接（Ag—Ab－生物素—亲和素＊）进行检测（图9－12）。该法也有相当高的灵敏度，由于省略了加标记生物素步骤，操作较BAB法简便。间接BA法也是采用生物素化的第二抗体，可以进一步提高检测灵敏度。

图9－12　BA法检测示意图

2.生物素－亲和素系统在酶免疫检测中的应用

（1）BAS在ELISA中的应用　将BAS与ELISA偶联起来，作为免疫测定的放大系统，可大大提高ELISA测定的灵敏度。BAS与ELISA偶联应用的形式有多种：①BAELISA，固相抗体＋待测抗原＋生物素化抗体＋酶标亲和素（或链霉亲和素）＋底物显色；②BAB－ELISA，固相抗体＋待测抗原＋生物素化抗体＋亲和素（或链霉亲和素）＋生物素酶＋底物显色；③ABC－ELISA，固相抗体＋待测抗原＋生物素化抗体＋亲和素（或链霉亲和素）_－生物素化酶复合物＋底物显色。

以上是用于检测未知抗原的三种方法。也可以利用标记抗原检测未知抗体，其方法与上述方法相似。

（2）BAS在均相酶免疫测定中的应用　BAS可以在均相酶免疫测定中应用，观察酶活性变化。均相酶免疫测定反应系统中，同时加有生物素－酶、亲和素－抗原、特异性抗体和待测抗原，由于抗体限量，待测抗原与亲和素－抗原复合物竞争与抗体结合。因此，反应体系中待测抗原浓度越高，则游离的亲和素－抗原复合物越多，最终测得的酶活性越低，即酶活性的变化与标本中抗原浓度呈剂量相关（反比）。

3.生物素－亲和素系统在荧光免疫技术中的应用

BAS用于荧光抗体技术，通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲和素（或链霉亲和素）；也可采用游离亲和素（或链霉亲和素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲和素（或链霉亲和素）抗体的夹心法。与常规免疫荧光法相比，引入BAS的荧光抗体技术可明显地提高方法的灵敏度和特异性。

4.生物素－亲和素系统在分子生物学中的应用

BAS在分子生物学领域中的应用日渐增多，目前主要集中用于以生物素标记核酸探针进行的定位检测；用BAS制备亲和吸附剂进行基因的分离纯化；将免疫测定技术与PCR结合建立免疫－PCR用于抗原的检测等。

（杨国宗）

重点提示

1.生物素的结构和功能　生物素分子结构中有两个环状结构，咪唑酮环是与亲和素或链霉亲和素（SA）结合的主要部位，四氢噻唑吩环的戊酸侧链末端羧基是与蛋白质（酶和抗体）结合的唯一结构。

2.亲和素（或链霉亲和素）特性　亲和素是生物素的天然特异性结合物，几乎与被标记的物质均可以结合，如大分子蛋白质和小分子标记物如125I、胶体金、荧光素和化学发光物，具有四个生物素结合部位，是建立生物素－亲和素（链霉亲和素）放大技术的重要基础。

3.BAS的特点及反应类型　BAS系统具有灵敏度高、特异性好、稳定性高、适用性广等特点。BAS在标记免疫分行技术应用两种基本类型：一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素，如BAB法和ABC法；另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法或LAB法。BAS在ELISA中的应用类型比较（直接法）如表9－6所示。

表9－6　BAS在ELISA中的应用类型比较

注：如用固相抗原，即可测抗体，采用第二抗体如Ag—Ab1—Ab2－生物素—亲和素＊，即为间接法，可使标记物具有通用性，适用于不同的反应体系，扩大应用范围。

4.生物素标记条件　将生物素进行化学修饰的过程称为生物素活化。只有活化的生物素才能与蛋白质（酶、抗体、抗原）或核酸结合，形成标记物。活化生物素可与蛋白质的氨基、醛基、巯基等多种方式结合，BNHS、BCNHS常用于标记带氨基的蛋白质（抗体、中性或偏碱性的抗原），BHZ、BCHZ用于标记带醛基、巯基和糖基的蛋白质（如偏酸性的抗原）。

5.BAS的用途　可用于多种免疫标记技术中，放大效应，提高检测技术的灵敏度，可定性、定量、定位检测。

目标检测

一、单项选择题

1.生物素－亲和素标记物制备的直接法常用（　　）。

A.戊二醛交联法　　B.过碘酸钠法　　C.搅拌法　　D.透析法　　E.氯胺T法

2.亲和素（链霉亲和素）的活性基团为（　　）。

A.亮氨酸　　B.精氨酸　　C.胱氨酸　　D.色氨酸　　E.酪氨酸

3.常用于标记核酸分子的活化生物素中下面哪一种除外？（　　）

A.光敏生物素　　B.生物素脱氧核苷三磷酸　　C.BNHS

D.BHZ　　　　　E.MPB

4.下面哪一项不是生物素－亲和素系统的特点？（　　）

A.灵敏度高　　B.特异性好　　C.成本高　　D.应用广泛　　E.稳定性高