还原糖的测定

    8.2.2.1 碱性铜盐法

    1.直接滴定法(GB/T5009.7—2008)

    1)原理

    将适量的酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即反应生成蓝色的氢氧化铜沉淀，生成的沉淀很快与酒石酸钾钠反应，络合生成深蓝色可溶的酒石酸钾钠铜络合物。试样经前处理后，在加热条件下，以亚甲蓝做指示剂，滴定标定过的碱性酒石酸铜溶液，样品中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化铜沉淀，微过量的还原糖会和亚甲基蓝反应，溶液中的蓝色会消失，即为滴定终点。根据样品液消耗体积计算还原糖含量。各步反应式(以葡萄糖为例)如下:

    Cu SO4+2Na OH===Cu(OH)2↓+Na2SO4

    2)试剂

    盐酸(HCl)，硫酸铜(Cu SO4·5H2O)，酒石酸钾钠(C4H4O5KNa·4H2O)，亚甲基蓝(C16H18Cl N3S·3H2O)指示剂，氢氧化钠(Na OH)，乙酸锌(Zn(CH3COO)2·2H2O)，冰乙酸(C2H4O2)，亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6·4H2O)，葡萄糖(C6H12O6)，果糖(C6H12O6)，乳糖(C6H12O6)，蔗糖(C12H22O11)。

    除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯。

    ①碱性酒石酸铜甲液: 称取15 g硫酸铜及0.05 g亚甲基蓝，溶于水中并稀释至1000m L。

    ②碱性酒石酸铜乙液: 称取50g酒石酸钾钠、75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000m L，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

    ③乙酸锌溶液(219g/L): 称取21.9g乙酸锌，加3m L冰乙酸，加水溶解并稀释至100m L。

    ④亚铁氰化钾溶液(106g/L): 称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至100m L。

    ⑤氢氧化钠溶液(40g/L): 称取4g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100m L。

    ⑥盐酸溶液(1+1): 量取50m L盐酸，加水稀释至100m L。

    ⑦葡萄糖标准溶液: 称取1g(精确至0.0001g)经过98℃～100℃干燥2h的葡萄糖，加水溶解后加入5m L盐酸，并以水稀释至1000m L。此溶液每毫升相当于1.0mg葡萄糖。

    ⑧果糖标准溶液: 称取1g(精确至0.0001g)经过98℃～100℃干燥2h的果糖，加水溶解后加入5m L盐酸，并以水稀释至1000m L。此溶液每毫升相当于1.0mg果糖。

    ⑨乳糖标准溶液: 称取1g(精确至0.0001g)经过96℃±2℃干燥2h的乳糖，加水溶解后加入5m L盐酸，并以水稀释至1000m L。此溶液每毫升相当于1.0mg乳糖(含水)。

    ⑩转化糖标准溶液: 准确称取1.0526g蔗糖，用100m L水溶解，转入具塞三角瓶中，加5m L盐酸(1+1)，在68℃～70℃水浴中加热15min，放置至室温，转移至1000m L容量瓶中并定容至1000m L，每毫升标准溶液相当于1.0mg转化糖。

    3)仪器

    ①酸式滴定管: 25m L。

    ②可调电炉: 带石棉板。

    4)分析步骤

    (1)试样处理

    ①一般食品: 称取粉碎后的固体试样2.5～5g或混匀后的液体试样5～25g，精确至0.001g，置250m L容量瓶中，加50m L水，慢慢加入5m L乙酸锌溶液及5m L亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。

    ②酒精性饮料: 称取约100g混匀后的试样，精确至0.01g，置于蒸发皿中，用氢氧化钠(40g/L)溶液中和至中性，在水浴上蒸发至原体积的1/4后，移入250m L容量瓶中，慢慢加入5m L乙酸锌溶液及5m L亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。

    ③含大量淀粉的食品: 称取10～20g粉碎后或混匀后的试样，精确至0.001g，置250m L容量瓶中，加200m L水，在45℃水浴中加热1h，并时时振摇。冷后加水至刻度，混匀，静置，沉淀。吸取200m L上清液至另一个250m L容量瓶中，慢慢加入5m L乙酸锌溶液及5m L亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。

    ④碳酸类饮料: 称取约100g混匀后的试样，精确至0.01g，试样置蒸发皿中，在水浴上微热搅拌除去二氧化碳后，移入250m L容量瓶中，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀后，备用。

    (2)标定碱性酒石酸铜溶液

    吸取5.0m L碱性酒石酸铜甲液及5.0m L碱性酒石酸铜乙液，置于150m L锥形瓶中，加水10m L，加入玻璃珠两粒，从滴定管滴加约9m L葡萄糖标准溶液或其他还原糖标准溶液，控制在2min内加热至沸腾，趁热以每2s1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液或其他还原糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液或其他还原糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每10m L(甲、乙液各5m L)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量或其他还原糖的质量(mg)［也可以按上述方法标定4～20m L碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各半)来适应试样中还原糖的浓度变化］。

    (3)试样溶液预测

    吸取5.0m L碱性酒石酸铜甲液及5.0m L碱性酒石酸铜乙液，置于150m L锥形瓶中，加水10m L，加入玻璃珠两粒，控制在2min内加热至沸腾，保持沸腾以先快后慢的速度，从滴定管中滴加试样溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每2s1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。当样液中还原糖浓度过高时，应适当稀释后再进行正式测定，使每次滴定消耗样液的体积控制在与标定碱性酒石酸铜溶液时所消耗的还原糖标准溶液的体积相近，约10m L左右，结果按式(8-1)计算。当浓度过低时则采取直接加入10m L样品液，免去加水10m L，再用还原糖标准溶液滴定至终点，记录所消耗的体积，并计算与标定时消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于10m L样液中所含还原糖的量，结果按式(8-2)计算。

    (4)试样溶液测定

    吸取5.0m L碱性酒石酸铜甲液及5.0m L碱性酒石酸铜乙液，置于150m L锥形瓶中，加水10m L，加入玻璃珠两粒，从滴定管滴加比预测体积少1m L的试样溶液至锥形瓶中，使在2min内加热至沸腾，保持沸腾继续以每2s1滴的速度滴定，直至蓝色刚好退去为终点，记录样液消耗体积，同时平行操作三份，得出平均消耗体积。

    (5)结果计算

    试样中还原糖的含量(以某种还原糖计)按式(8-1)进行计算:

    式中: X——试样中还原糖的含量(以某种还原糖计)，单位为克每百克(g/100g);

    m1——碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各半)相当于某种还原糖的质量，单位为毫克(mg);

    m——试样质量，单位为克(g);

    V——测定时平均消耗试样溶液体积，单位为毫升(m L)。

    当浓度过低时试样中还原糖的含量(以某种还原糖计)按式(8-2)进行计算:

    式中: X——试样中还原糖的含量(以某种还原糖计)，单位为克每百克(g/100g);

    m2——标定时体积与加入样品后消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于某种还原糖的质量，单位为毫克(mg);

    m——试样质量，单位为克(g)。

    还原糖含量≥10g/100g时，计算结果保留三位有效数字; 还原糖含量＜10g/100g时，计算结果保留两位有效数字。

    (6)说明与注意事项

    ①该方法试剂用量少，操作简单快速，终点明显，准确度高，重现性好，可广泛适用于各类食品中的还原糖的测定。

    ②碱性酒石酸甲液和乙液要现用现配，如若配制好放置的时间过长会导致酒石酸钾钠铜络合物解析出氧化亚铜沉淀，而导致试剂浓度降低。

    ③由于产物中含有有色产物氧化亚铜，会对滴定终点的判断产生影响，为了减小实验误差，提高准确度，我们可以向碱性酒石酸钾钠铜乙液中添加少量的亚铁氰化钾，亚铁氰化钾会和氧化亚铜络合，从而使滴定的结果更容易判断。

    ④滴定必须在沸腾的条件下进行，因为氧气会和指示剂反应，导致滴定终点延迟，通过在沸腾条件下进行以保证空气中的氧气难以和指示剂接触，从而避免了此种情况的发生，同时在滴定过程中还要注意尽量减少不必要的摇动且不要把锥形瓶移开热源。

    ⑤如果条件允许，可以进行预实验。通过预实验可以估计样液的大概消耗量，避免滴定过量。

    2.高锰酸钾滴定法(GB/T5009.7—2008)

    1)原理

    试样经除去蛋白质后，其中还原糖把铜盐还原为氧化亚铜，加硫酸铁后，氧化亚铜被氧化为铜盐，以高锰酸钾溶液滴定氧化作用后生成的亚铁盐，根据高锰酸钾消耗量，计算氧化亚铜含量再查附表1得还原糖量。

    Cu2O+Fe2(SO4)3+H2SO4===2Cu SO4+2Fe SO4+H2O

    10Fe SO4+2KMn SO4+8H2SO4===5Fe(SO4)3+2Mn SO4+K2SO4+8H2O

    2)试剂

    除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯。

    硫酸铜(Cu SO4·5H2O)，氢氧化钠(Na OH)，酒石酸钾钠(KNa C4H4O6·4H2O)，硫酸铁(Fe2(SO4)3)，盐酸(HCl)。

    ①碱性酒石酸铜甲液: 称取34.639g硫酸铜，加适量水溶解，加0.5m L硫酸，再加水稀释至500m L，用精制石棉过滤。

    ②碱性酒石酸铜乙液: 称取173g酒石酸钾钠、50g氢氧化钠，加适量水溶解，并稀释至500m L，用精制石棉过滤，贮存于胶塞玻璃瓶内。

    ③氢氧化钠溶液(40g/L): 称取4g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100m L。

    ④硫酸铁溶液(50g/L): 称取50g硫酸铁，加入200m L水溶解后，慢慢加入100m L硫酸，冷却，加水稀释至1000m L。

    ⑤盐酸(3mol/L): 量取30m L盐酸，加水稀释至120m L。

    ⑥高锰酸钾标准溶液［c(1/5KMn O4) =0.1000mol/L］。

    ⑦精制石棉: 取石棉先用盐酸(3mol/L)浸泡2～3d，用水洗净，再加氢氧化钠溶液(40 g/L)浸泡2～3d，倾去溶液，再用热碱性酒石酸铜乙液浸泡数小时，用水洗净。再以盐酸(3 mol/L)浸泡数小时，以水洗至不呈酸性为止。然后加水振摇，使成细微的浆状软纤维，用水浸泡并贮存于玻璃瓶中即可作填充古氏坩埚用。

    3)仪器

    ①25m L古氏坩埚或G4垂融坩埚。

    ②真空泵。

    4)分析步骤

    (1)试样处理

    ①一般食品: 称取粉碎后的固体试样2.5～5g或混匀后的液体试样25～50g，精确至0.001g，置250m L容量瓶中，加水50m L，摇匀后加10m L碱性酒石酸铜甲液及4m L氢氧化钠溶液(40g/L)，加水至刻度，混匀。静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。

    ②酒精性饮料: 称取约100g混匀后的试样，精确至0.01g，置于蒸发皿中，用氢氧化钠溶液(40g/L)中和至中性，在水浴上蒸发至原体积的1/4后，移入250m L容量瓶中。加50 m L水，摇匀后加10m L碱性酒石酸铜甲液及4m L氢氧化钠溶液(40g/L)，加水至刻度，混匀。静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。

    ③含大量淀粉的食品: 称取10～20g粉碎或混匀后的试样，精确至0.001g，置250m L容量瓶中，加200m L水，在45℃中加热1h，并时时振摇。冷却后加水至刻度，混匀静置。吸取200m L上清液置另一250m L容量瓶中，摇匀后加10m L碱性酒石酸铜甲液及4m L氢氧化钠溶液(40g/L)，加水至刻度，混匀。静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。

    ④碳酸类饮料: 称取约100g混匀后的试样，精确至0.01g，试样置于蒸发皿中，在水浴上除去二氧化碳后，移入250m L容量瓶中，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀后备用。

    (2)测定

    吸取50m L处理后的试样溶液，于400m L烧杯内，加入25m L碱性酒石酸铜甲液及25 m L乙液，于烧杯上盖一表面皿，加热，控制在4min内沸腾，再准确煮沸2min，趁热用铺好石棉的古氏坩埚或G4垂融坩埚抽滤，并用60℃热水洗涤烧杯及沉淀至溶液不呈碱性为止。将古氏坩埚或垂融坩埚放回原400m L烧杯中，加25m L硫酸铁溶液及25m L水，用玻棒搅拌使氧化亚铜溶解，以高锰酸钾标准溶液［c(1/5KMn O4) =0.1000mol/L］滴定至微红色为终点。

    同时吸取50m L水，加入与测定试样时相同量的碱性酒石酸铜甲液、乙液、硫酸铁溶液及水，按同一方法做空白试验。

    5)结果计算

    试样中还原糖质量相当于氧化亚铜的质量，按式(8-3)进行计算。

    X=(V-V0) ×c×71．54 (8-3)

    式中: X——试样中还原糖质量相当于氧化亚铜的质量，单位为毫克(mg);

    V——测定用试样液消耗高锰酸钾标准溶液的体积，体积为毫升(m L);

    V0——试剂空白消耗高锰酸钾标准溶液的体积，单位为毫升(m L);

    c——高锰酸钾标准溶液的试剂浓度，单位为摩尔每升(mol/L);

    71.54——1m L1.000mol/L高锰酸钾溶液相当于氧化亚铜的质量，单位为毫克(mg)。

    根据式中计算所得氧化亚铜质量，查附表1，再计算试样中还原糖含量，按式(8-4)进行计算。

    式中: X——试样中还原糖的含量，单位为克每百克(g/100g);

    m3——查表得还原糖质量，单位为毫克(mg);

    m4——试样质量(体积)，单位为克或毫升(g或m L);

    V——测定用试样溶液的体积，单位为毫升(m L);

    250——试样处理后的总体积，单位为毫升(m L)。

    还原糖含量≥10g/100g时，计算结果保留三位有效数字; 还原糖含量＜10g/100g时，计算结果保留两位有效数字。

    6)说明与注意事项

    ①该方法准确度和重现性都优于直接滴定法，但操作较为繁琐费时，需要使用专用的检索表。适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液也不受限制。

    ②所用的碱性酒石酸铜溶液与直接滴定法不同:

    碱性酒石酸铜甲液: 称取34.639g硫酸铜，加适量水溶解，加0.5m L硫酸，再加水稀释至500m L，用精制石棉过滤。

    碱性酒石酸铜乙液: 称取173g酒石酸钾钠、50g氢氧化钠，加适量水溶液，并稀释至500m L，用精制石棉过滤，贮存于胶塞玻璃瓶内。

    ③所用碱性酒石酸铜溶液必须要过量，以保证煮沸后的溶液呈蓝色。必须控制好热源的强度，保证在4min内加热至沸腾。

    ④在过滤及洗涤氧化亚铜沉淀的整个过程中，应使沉淀始终在液面以下，避免氧化亚铜暴露于空气中而被氧化。生成的氧化亚铜用铺好石棉的古氏坩埚或G4垂融坩埚抽滤，并用60℃热水洗涤烧杯及沉淀，至洗涤液不呈碱性为止。

    ⑤还原糖与碱性酒石酸铜溶液反应复杂，不能根据化学方程式计算还原糖含量，而需要利用检索表。

    3.萨氏法

    1)原理

    将一定的样液与过量的碱性铜盐溶液共热，样液中的还原糖定量地将二价铜还原为氧化亚铜。反应式同直接滴定法。

    氧化亚铜在酸性条件下溶解为一价铜离子，同时碘化钾被碘酸钾氧化后析出游离碘。

    氧化亚铜溶解于酸后，将碘还原为碘化物，而本身从一价铜被氧化为二价铜。

    剩余的碘与硫代硫酸钠标准溶液反应

    I2+2Na2S2O3===Na2S4O6+2Na I

    根据硫代硫酸钠标准溶液消耗量可求出与一价铜反应的碘量，从而计算出样品中还原糖含量。计算公式如(8-5)所示:

    式中: V——测定用样液消耗Na2S2O3标准溶液体积，单位为m L;

    V0——空白实验消耗Na2S2O3标准溶液的体积，单位为m L;

    S——还原糖系数(mg/m L)，即1m L0.005mol/LNa2S2O3标准溶液相当于还原糖的量(mg);

    f——Na2S2O3标准溶液浓度校正系数，f=实际浓度/0.005;

    V1——样液总体积，单位为m L;

    V2——测定用样液体积，单位为m L;

    m——样品质量，单位为g。

    2)说明与注意事项

    ①该法是一种微量法，检出量为0.015～3mg，灵敏度高，重现性好，因样液用量少，故可用于生物材料或经过层析处理后的微量样品的测定，终点清晰，有色样液不受限制。

    ②碘化钾不加在萨氏试剂中，而在临用前再加入，可避免生成的Cu2O沉淀溶解，增加Cu2O与氧接触的机会，使其再被氧化。

    ③沉淀指示剂不宜加入过早，否则会形成大量的沉淀吸附物，到达滴定终点时仍不褪色。

    8.2.2.2 铁氰化钾法

    1)原理

    还原糖在碱性溶液中将铁氰化钾还原为亚铁化钾，本身被氧化为相应的糖酸。

    剩余的铁氰化钾在乙酸的存在下，与过量的碘化钾作用析出碘。

    2K3Fe(CN)6+2KI+8CH3COOH===2H4Fe(CN)6+I2↓+8CH3COOK

    析出的碘用硫代硫酸钠标准溶液滴定。

    Na2S2O3+I2===2Na I+Na2S4O6

    由于反应是可逆的，为了使反应正向进行，用硫酸锌沉淀反应中所生成的亚铁化钾。

    2K4Fe(CN)6+3Zn SO4===KZn［Fe(CN)6］2+3K2SO4

    实验表明，如试样中还原糖含量多时，剩余的铁氰化钾量少，而与碘化钾作用析出的游离碘也少，因此滴定游离碘所消耗的硫代硫酸钠量也少; 反之，试样中还原糖含量少时，滴定游离碘所消耗的硫代硫酸钠则多。但还原糖量与硫代硫酸钠之间不符合摩尔关系，因而不能根据上述反应式直接计算出还原糖含量。而是首先按照公式(8-6)计算出氧化还原糖时所用去的铁氰化钾的量，再通过查经验表(见附表2)的方法即可查得试样中还原糖的百分数。

    式中: V——氧化样品液中还原糖所需0.1mol/L铁氰化钾溶液的体积，单位为m L;

    V0——滴定空白液消耗硫代硫酸钠溶液体积，单位为m L;

    V1——滴定样品液消耗硫代硫酸钠溶液体积，单位为m L;

    c——硫代硫酸钠溶液的浓度，单位为mol/L。

    2)适用范围及特点

    本法的特点是滴定终点明显、准确度高、重现性好，适用于各类食品中还原糖的测定，是粮食、油料等样品中还原糖测定的国家标准分析方法。

    8.2.2.3 其他测定方法简介

    1)苯酚-硫酸法

    (1)原理

    糖类在浓硫酸作用下，非单糖水解为单糖，单糖再脱水生成的糠醛或糠醛衍生物能与苯酚缩合成橙红色化合物，在一定的范围内，其颜色深浅与糖含量成正比，在480～490nm波长下，吸光值与糖含量呈线性关系，因此可比色测定。

    糖类物质与浓硫酸作用脱水，生成糠醛或糠醛衍生物。反应式如下:

    (2)主要试剂

    ①80%(质量分数)苯酚溶液: 称取精制苯酚80g，加去离子水20m L溶解，定容于100 m L棕色容量瓶中。

    ②100mg/L的葡萄糖储备液，浓硫酸(相对密度1.84)。

    (3)测定方法

    ①制作标准曲线: 准确称取标准葡聚糖(或葡萄糖)20mg于200m L容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4m L，0.6m L，0.8m L，1.0m L，1.2m L，1.4m L，1.6m L及1.8m L，各以蒸馏水补至2.0m L，然后加入6%苯酚1.0m L及浓硫酸5.0m L，摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0m L水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为吸光度值，得标准曲线。

    ②样品含量测定: 吸取2.0m L样品，然后加入6%苯酚1.0m L及浓硫酸5.0m L，摇匀后冷却至室温放置30min，于490nm波长处测吸光度。每次测定取双样对照，以标准曲线计算多糖含量。

    (4)适用范围及特点

    本法适用于各种食品中还原糖的测定，尤其是层析法分离洗涤之后样品中糖的测定。此法简单、快速、灵敏、重现性好，颜色持久，对每种糖仅需制作一条标准曲线。最低检测量为10μg，误差为2%～5%。

    2)3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法

    (1)原理

    在氢氧化钠和丙三醇存在下，还原糖能将3，5-二硝基水杨酸中的硝基还原为氨基，生成氨基化合物。反应式如下:

    此化合物在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈橘红色，在波长540nm处有最大吸收，其吸光度与还原糖含量有线性关系。

    (2)适用范围及特点

    此法适用于各类食品中还原糖的测定，相对误差为2.2%，具有准确度高、重现性好、操作简便、快速等优点，分析结果与直接滴定法基本一致，尤其是适用于大批样品的测定。

    3)酶-比色法

    (1)原理

    葡萄糖氧化酶(GOD)在有氧条件下，催化β-D-葡萄糖(葡萄糖水溶液状态)氧化，生成D-葡萄糖-δ-内酯和过氧化氢，受过氧化物酶(POD)催化，过氧化氢与4-氨基安替比林和苯酚生成红色醌亚胺。在波长505nm处测定醌亚胺的吸光度，可计算出食品中葡萄糖的含量。

    (2)计算公式

    式中: ω——样品中葡萄糖的含量，%;

    m1——标准曲线上查出的试液中葡萄糖含量，g;

    m2——试样的质量，μg;

    V1——试液的定容体积，m L;

    V2——测定时吸取试液的体积，m L。

    (3)适用范围及特点

    本法适用于各类食品中葡萄糖的测定，也适用于食品中其他组分转化为葡萄糖的测定。最低检出限量是0.01μg/m L，为仲裁法。由于葡萄糖氧化酶(GOD)具有专一性，只能催化葡萄糖水溶液β-D-葡萄糖被氧化，不受其他还原糖的干扰，因此测定结果较直接滴定法和高锰酸钾法准确。