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单克隆抗体如何检测多态性抗原

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单克隆抗体如何检测多态性抗原

    

    (一)概念

    1.单克隆抗体(McAb) 是由一个B细胞克隆合成的、只能与一种相应抗原表位特异结合的完全均一的Ig。完全均一指Ig的血清型、理化性状、与抗原结合的特异性等高度均一。

    2.多克隆抗体 天然抗原常有多种不同抗原表位,因此可刺激体内多个B细胞克隆活化并产生针对多种不同抗原表位的抗体,其混合物即为多克隆抗体,血清及组织液中的抗体就是多克隆抗体。

    (二)杂交瘤技术

    1.基本原理 由一个小鼠脾细胞和一个小鼠骨髓瘤细胞通过细胞膜融合而形成的多倍体细胞系称为B细胞杂交瘤(hybridoma)细胞。

    正常脾细胞特性:具有次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT),用选定抗原免疫后可合成针对该抗原的Ab,在人工合成培养液中只能传1~2代。

    骨髓瘤细胞特性:不能合成分泌Ig、缺乏HGPRT,稳定易培养,能在人工合成培养液中无限传代,易于和脾细胞融合。

    B杂交瘤细胞同时具有合成分泌特异性抗体以及在体外无限传代的能力,而由一株B杂交瘤细胞合成分泌的均一同源抗体即是单克隆抗体。

    2.B细胞杂交瘤技术

    (1)选择培养基——HAT培养液:HAT培养液中含有三种关键的有机物质:次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。

    哺乳类细胞的DNA从头合成途径利用磷酸核糖焦磷酸和尿嘧啶合成DNA,但可被叶酸拮抗药氨基蝶呤阻断;补救合成途径可在HGPRT催化下利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成DNA。

    在HAT选择培养基中,骨髓瘤细胞因其从头合成途径被氨基蝶呤阻断而又缺乏HGPRT,不能利用补救途径合成DNA,因而死亡;而脾细胞虽有HGPRT仍能合成DNA,但因不能在体外传代培养而死亡;B杂交瘤细胞可在HAT选择培养基中生长、繁殖和传代。

    (2)细胞融合:在聚乙二醇(PEG)作用下,脾细胞和骨髓瘤细胞可发生细胞膜融合形成多倍体细胞。

    (3)杂交瘤细胞的稀释与选择:细胞两两融合是随机的,要获得能合成分泌所需单克隆抗体的杂交瘤细胞,必须在细胞培养板上将融合细胞充分稀释,进行克隆化处理,然后取每一杂交瘤细胞株的培养液与目标抗原进行体外抗原抗体反应,筛选合成特异性抗体的阳性细胞株。

    3.制备技术

    (1)单克隆抗体的产生:利用DNA补救合成途径机制在HAT培养液中选择出能合成所需抗体的杂交瘤细胞,然后利用小鼠体内诱生法或体外细胞培养法大量培养增殖,制备所需的单克隆抗体。

    (2)单克隆抗体的纯化:常用的单克隆抗体纯化方法除盐析法、凝胶过滤法外,还有离子交换层析法和辛酸提取法等。

    (3)单克隆抗体的性质鉴定:单克隆抗体性质鉴定一般采用免疫标记技术,最常用的为ELISA方法,一般先做定性试验,如阳性结果则进一步做定量检测。

    (三)基因工程抗体

    基因工程抗体是用基因工程技术改造鼠源性单克隆抗体的基因,保留其V区的抗原结合部位,尽量减少C区的鼠源成分,降低其异源性,从而创造出的新型抗体。

    1.人源化抗体 是用基因工程技术尽量减少鼠源单克隆抗体中非V区的鼠源成分而创造出的一种新型抗体。如人-鼠嵌合抗体,是通过基因拼接技术将人IgG-C区的DNA片段与鼠IgGV区的DNA拼接后,导入细胞内表达制备而成的抗体。

    2.小分子抗体 是具有抗原结合功能的Ig分子片段,包括Fab和Fv,单链抗体,单区抗体等。

    3.抗体融合蛋白 将抗体分子片段与其他蛋白融合,如将Fv与某些毒素、酶、细胞因子拼连,抗体作为定位导向物,可携带融合蛋白结合在靶细胞特定部位,发挥融合蛋白的生物学效应,即所谓“生物导弹”。

    4.双特异性抗体 是由识别不同抗原表位的两个小分子抗体连接构成,能同时识别并结合两种抗原。

    5.抗体库技术及应用 抗体库技术是指通过基因克隆技术将全套抗体重链及轻链可变区基因DNA序列克隆出来,与可表达质粒载体重组,通过宿主细菌直接表达有功能的抗体分子片段,然后筛选出特异目标的可变区基因。现有组合抗体库技术及菌体抗体库技术。

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