12.3 免疫传感器
12.3.1 免疫概述
免疫（Immunity）是指机体对病原生物感染的抵抗能力，可分为自然免疫和获得性免疫。自然免疫是非特异性的，即能抵抗多种病原微生物的损害，如完整的皮肤、粘膜、吞噬细胞、补体、溶菌酶、干扰素等。获得性免疫一般是特异性的，在微生物等抗原物质刺激后才形成的，并能与该抗原起特异性反应，如免疫球蛋白等。这种由抗原刺激机体产生的具有特异性免疫功能的球蛋白称为抗体。
免疫识别是最为重要的生物化学分析方法之一，可用于测量各种抗体、抗原、半抗原以及能进行免疫反应的多种生物活性物质（例如激素、蛋白质、药物、毒物等）。
抗原是能够刺激动物机体产生免疫反应的物质，但从广义的生物学观点看，凡是具有引起免疫反应性能的物质都可以称为抗原。抗原有两种性能:刺激机体产生免疫应答反应；与相应免疫反应产物发生特异性的结合反应。具有刺激免疫应答反应的抗原是完全抗原；那些只可与抗体发生特异性结合，不刺激免疫应答反应的抗原称为半抗原。
抗原有以下3种类型:
（1）天然抗原:来源于微生物或动物、植物，包括细菌、病毒、血细胞、花粉、可溶性抗原毒素、类毒素、血清蛋白、蛋白质、糖蛋白等。
（2）人工抗原:经化学或其他方法变性的天然抗原，如碘化蛋白、偶氮蛋白和半抗原结合蛋白。
（3）合成抗原:化学合成的多肽分子。
12.3.2 免疫传感器工作原理
利用抗体对抗原的识别并能与抗原结合的功能构成的生物传感器称为免疫传感器。免疫传感器的原理就是生物的免疫反应。
酶和微生物传感器主要以低分子有机化合物作为测量对象，对高分子有机化合物识别能力不佳。利用抗体对抗原的识别和结合功能，可构成对蛋白质、多糖类等高分子有较高选择性的免疫传感器。它利用固定化抗体（或抗原）与相应的抗原（或抗体）的特异反应，此反应的结果使生物敏感膜的电位发生变化，一般可分为标记免疫传感器和非标记免疫传感器。
1.标记免疫传感器
标记免疫传感器（也称间接免疫传感器）以酶、红细胞、放射性同位素、稳定的游离基、金属、脂质体及噬菌体等为标记物。其原理如下:等当量的标记抗原和抗体发生反应时，全部抗原与全部抗体将结合，形成复合体。取等当量的标记抗原和抗体，再加入被测非标记抗原，此时，由于标记抗原和非标记抗原在与抗体反应形成复合体的过程中发生竞争，使复合体中标记抗原量减少，据此可测定出抗原、抗体反应前存在的非标记抗原量（即被测对象）的数量。
采用具有化学放大作用的酶作标记物组成的标记酶免疫传感器具有较高的灵敏度。此类传感器的选择性依据抗体的识别功能，其灵敏度依赖于酶的放大作用。一个酶分子每半分钟就可使103～106个底物分子转变为产物，因此标记酶免疫传感器的灵敏度高。这种标记酶免疫传感器的工作原理主要有竞争法和夹心法，如图12-6所示。
（1）竞争法
如图12-6（a）所示，①在含有被测量对象的非标记抗原试液中，加入一定量的过氧化氢酶标记抗原（酶共价结合在抗原上）。标记抗原和非标记抗原在抗体膜表面上竞争并形成抗原、抗体复合体；②洗涤抗体膜，除去未形成复合体的游离抗原。将洗涤后的传感器浸入过氧化氢溶液中；③结合在抗体膜表面上的过氧化氢酶将催化H2O2分解:
生成的O2向抗体膜的透氧膜扩散，在Pt阴极上被还原，通过氧电极求得O2量，进而可求得结合在膜上的标记酶量。若使标记酶抗原量一定，当非标记抗原量（被测对象）增加时，则结合在抗体膜上的酶标记抗原量将减少，O2的还原电流也减小。利用这种传感器可以测量人的血清白蛋白（HAS，Human Serum Albumin）。
图12-6 标记酶免疫传感器工作原理
（a）竞争法；（b）夹心法
（2）夹心法
如图12-6（b）所示。夹心法采用了双抗体，其原理与竞争法类似，是将样品中的抗原（被测量）与已固定在载体上的第一抗体结合，洗去未结合的抗原后，再加入标记抗体（第二抗体），使其与已结合在第一抗体上的抗原结合，这样抗原被夹在第一抗体与第二抗体之间，洗去未结合的标记抗体，测定已结合的标记抗体的酶活性就可求出待测抗原量。
现以测量人绒毛膜促性腺素（Human Chorionic Gonadotropin，HCG）用的酶免疫传感器为例来说明。通过固定抗体膜测量HCG的过程可分以下步骤:
①免疫化学反应
②酶催化反应
③Pt电极上氧的电化学还原反应
这种传感器是在Clark氧电极的透气膜上紧贴一层固定抗体膜构成。氧电极可由Pt阴极、Ag/AgCl阳极、KCl电解液及聚乙烯透氯膜组成。在将固定HCG抗体膜安装在氧电极之前，应先按夹心法反应步骤完成免疫反应，形成夹心结构膜，然后用“O”型有机玻璃环将其安装在氧电极的透气膜上。测量时先在小型玻璃电解池中注入10mL、pH值为8.0的磷酸缓冲溶液，以99转/分恒速搅拌，5分钟时记录溶解氧的含量。然后向电解液中滴入100μL 30%的H2O2溶液，再次记录5分钟后溶解氧的含量，求得溶解氧的浓度变化。
酶免疫传感器测量HCG，具有选择性强、灵敏度高、响应快、无污染等特点。若采用HCG单克隆抗体制备固定化膜，则选择性和灵敏度还可进一步提高。
2.非标记免疫传感器
非标记免疫传感器（也称直接免疫电极）不用任何标记物。其原理为:蛋白质分子（抗原或抗体）携带有大量电荷，当抗原、抗体结合时会产生若干电化学或电学变化，从而导致相关参数如介电常数、电导率、膜电位、离子通透性、离子浓度等的变化，检测其中一种参数的变化，便可测得免疫反应的发生以及被测量（抗原）的多少。
非标记免疫传感器能使抗原、抗体在受体表面形成抗原、抗体复合体，并将随之产生的物理变化转换为电信号。
非标记免疫传感器按测量方法分两种:一种是把抗体（或抗原）固定在膜表面成为受体，测量免疫反应前后的膜电位变化，如图12-7（a）所示；另一种是把抗体（或抗原）固定在金属电极表面成为受体，然后测量伴随免疫反应引起的电极电位变化，如图12-7（b）所示。
图12-7 非标记免疫电极测量方法
（a）固定抗体于膜表面法；（b）固定抗体于金属电极表面法
抗体膜（或抗原膜）与不同浓度的1-1价型电解质溶液（如KCl）接触时，其膜电位ΔV1近似为
式中:θ为膜电荷密度；t为迁移率；γ＝C1/C2；C1、C2为电解质浓度。
此时将在抗体膜表面上形成抗原、抗体复合体。通过洗涤，除去未形成复合体的抗原和其他共存物质。在相同条件下测量抗原、抗体反应后的膜电位ΔV2，则由ΔV＝ΔV2-ΔV1可求出抗原浓度（注意应固定被测抗原浓度以外的各项因素不变，例如膜的抗体密度、抗原与抗体反应时间、膜电位测量条件等）。
非标记免疫电极的特点是不需额外试剂，仪器要求简单，操作容易，响应快；不足的是灵敏度较低，样品需求量较大，非特异性吸附会造成假阳性结果。
标记免疫传感器与非标记免疫传感器相比，在目前更具实用性，一些酶免疫传感器已经在临床分析上应用于测量IgG、HCG，检测极限可达10-9～10-12g/mL。这类传感器所需样品量少，一般只要数微升至数十微升，灵敏度高，选择性好，可作为常规方法使用，但需加标记物，操作过程也较复杂。
免疫传感器在实际应用中的一个重要问题是免疫电极的再生。免疫电极在进行一次测量后，需要使电极表面的络合物离解才能反复使用。一般说来，抗原、抗体反应的亲和常数大于离解常数，络合物的离解速度远小于络合物的形成速度，可以通过改变溶液的pH值或离子强度来促进离解。多数情况下用稀酸（0.01mol/L乙酸或0.01mol/L盐酸），也可用pH值为10左右的0.1mol/L NH4OH，还可用盐酸胍、尿素等蛋白质变性剂这一类强烈手段，但应注意不得使敏感膜失活。
免疫电极敏感膜再生是难度较大的实用技术，且由于膜再生是免疫电极可重复使用的前提，故也在一定程度上限制了免疫传感器的应用。
12.3.3 免疫传感器的应用
1.利用声表面谐振波型免疫传感器检测塑料炸弹
爆炸物的检测是反恐的重要任务之一，本节介绍的基于声表面波的免疫传感器就是自“911”事件后，美国政府资助研究的用于对爆炸物的气相挥发物进行检测的免疫传感器。
基于声表面波（SAW）装置的免疫传感器的原理结构如图12-8所示，在SAW装置的表面固定一层单层抗体膜来构建气相生物传感器的敏感单元，利用抗体和抗原（被测对象）的结合，改变自身的谐振频率，根据频率变化的情况就能够准确地识别被测对象。这种传感器目前已成为检测气态小分子日益流行的分析工具。
气相传感装置应具有的两大性能是敏感性和选择性。通过改进传感器的结构设计可以提高传感器的敏感性，而传感器的选择性则取决于装置表面的化学感应膜的性能。
图12-8 SAW免疫传感器示意图
图12-9 基于SAW免疫传感器的爆炸物检测系统图
TNT（三硝基甲苯）和RDX（三次甲基三硝基胺）是80%的地雷、简易炸弹和其他爆炸物的主要原料，因此可采用反TNT和反RDX抗体作为生物免疫敏感膜，对爆炸物的气相挥发物进行检测。
爆炸物的气相样本是由美国爆炸物检测委员会专门提供的。图12-9是声表面谐振波型免疫传感器的爆炸物检测系统的示意图。多个声表面谐振波免疫传感器构成一个测量爆炸物的气相挥发物的传感阵列。抗体层被固定在声表面谐波发生器的每一个表面上。
被测物注入到流通池后，为了尽可能地减少如气压、温度等干扰信号的影响，从不规范的振动开始采样。最终得到的参考传感器频率数据是从每一个检测传感器得到的数据中抽样出来的。
图12-10为室外空地进行爆炸物检测的实验结果。爆炸物样本被随机的安置在某个地点，这样检测系统受到的干扰信号也就是随机的。图中是使用RDX和硝酸铵为被测样本，采用反TNT和反RDX为抗体得到的数据。图12-10表明不同的抗体和对应抗原（被测物）的结合，会使传感器的频率发生非常显著的变化，这种变化和爆炸物的气相挥发物的浓度成比例关系。
图12-10 爆炸物检测实验结果
（a）以RDX为样本的采集信号；（b）以硝酸铵为样本的采集信号
实验表明，声表面谐波发生器固有的高增益和抗原抗体间高效的免疫反应，使得该免疫传感器具有灵敏度高、选择性好的特点。在抗体固定不动的条件下，可在爆炸样本低挥发的状态下成功地检测出目标。同时，该检测系统可在线实时完成爆炸物的检测，避免了像ELISA（酶联免疫吸附试验）那样的长时间的生物化学处理过程。
2.免疫传感器的发展趋势
免疫传感器是活性单元（抗体或抗原）与电子信号转换元件（换能器）的结合。一方面，免疫传感器以抗体—抗原亲和反应为识别基础，所以具有很高的选择性；另一方面，免疫活性单元是用一定的基体固定在检测仪器上的，基体和附在其上的共存物引入的非专一性反应就可能影响免疫反应的专一性。这种来自于基体和共存物的干扰仍是免疫传感器研究中有待解决的—个问题。
抗体敏感性与可逆性是免疫传感器技术的另一个重要问题。快速的可逆性与高度的敏感性相互制约，这在平衡反应中显而易见。作为受体应能进行可逆性结合，否则当受体与配基结合后，只有采用新合成的受体。解决办法之一是附以另外的生化装置，使受体与配基的结合复原，例如，对于受体与配基结合形成的乙酰胆碱，通过加入胆碱酯酶可将乙酰胆碱分解成乙酸和胆碱，使受体恢复原态。此外，免疫传感器发展的另一趋势是供一次性使用的传感器，这就要求研究的重点放在能大规模、廉价生产和使用简便的技术上。
随着免疫传感器技术应用范围的扩大，传统的抗体生产不能满足要求。抗体的产生取决于免疫技术，传统技术费时费力，且难以保证每次都能成功。因而寄希望于用重组方法生产抗体，以缩短免疫时间。重组抗体生产的一般过程为:医学上为治疗过敏反应，采用重组抗体（rAb）生产技术得到了人源化的抗体。目前，抗体生产技术正逐渐从传统的单克隆技术转变为现代基因工程技术。后者因为无需进行极其复杂的细胞培养而显示其突出的优越性。
免疫传感器相对于一般免疫检测方法的主要优势在于，它不但能弥补目前常规免疫检测方法不能进行定量测量的缺点，而且还能实时地监测抗原—抗体反应，不需分离步骤，即在抗原—抗体反应的同时就可把反应信号动态而连续地记录下来，有利于抗原—抗体反应的动力学分析；另外，它还可以使免疫检测手段朝自动化、简便化和快速化方向发展。
总之，集生物学、物理学、化学及医学为一体的免疫传感技术是近年来生物传感器研究中的前沿课题，它不但能推动传统免疫测试法的发展，而且将对临床检验和环境监测等许多领域产生深远影响。
