分枝杆菌菌种鉴定

    

    一、分枝杆菌菌种鉴定流程

    1．经抗酸染色镜检确定是抗酸菌的培养阳性菌株，必须首先接种改良罗氏（L－J）培养基进行增菌传代。

    2．进行分枝杆菌菌种鉴定，首先经对硝基苯甲酸（PNB）生长实验、28℃生长实验、耐热触酶实验、观察记录细菌的生长速度、菌落形态和菌落颜色确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群还是非结核分枝杆菌（NTM）。

    3．经菌群鉴定实验确定属于结核分枝杆菌复合群的菌株，需进行噻吩－2－羧酸肼（TCH）生长实验、硝酸还原实验和烟酸实验进行菌种鉴定。

    4．属于非结核分枝杆菌（NTM）的菌株，首先根据生长速度的快慢确定属于快速生长还是缓慢生长的分枝杆菌。快速生长的分枝杆菌可通过生长特征和生化实验进行菌种鉴定；缓慢生长的分枝杆菌经色素产生实验确定菌株的产色特征后，再通过生长特征和生化实验确定菌株的种类（图2－5）。

    

图2－5 分枝杆菌菌种（菌群）鉴定实验流程

    二、分枝杆菌菌群鉴定实验

    分枝杆菌菌群鉴定的目的既是鉴定菌株属于结核分枝杆菌复合群还是非结核分枝杆菌（NTM），也是进行进一步菌种鉴定的基础。

    分枝杆菌菌群主要通过菌株在含对硝基苯甲酸（PNB）的鉴别培养基上的生长情况、28℃生长情况及生长速度、耐热触酶实验及观察菌株的菌落形态、颜色等生物特征来进行区分。通过上述实验，可将需要鉴定的菌株划归结核分枝杆菌复合群或非结核分枝杆菌（NTM）菌群。

    （一）对硝基苯甲酸（PNB）生长实验

    结核分枝杆菌复合群在含有PNB的培养基中生长受到抑制；大多数NTM菌种对一定浓度的PNB有耐受性。

    1．培养基 PNB培养基（含PNB 500mg／ml的L－J培养基）1支，L－J培养基1支。

    2．实验方法 每支培养基接种0．001mg细菌；37℃孵育，每周观察1次结果，同时记录PNB培养基和L－J培养基上菌落生长情况直至孵育4周。快速生长的非结核分枝杆菌1周左右可见菌落；缓慢生长的分枝杆菌4周报告结果。结核分枝杆菌复合群在PNB培养基上不生长。

    3．阳性对照菌株 堪萨斯分枝杆菌（M．kansasii）。

    4．阴性对照菌株 H37Rv。

    （二）28℃生长实验

    结核分枝杆菌复合群在28℃的孵育环境中不能生长；而非结核分枝杆菌（NTM）菌群的大部分分枝杆菌可以生长。

    1．培养基 2支L－J培养基。

    2．实验方法 每支L－J培养基接种0．001mg细菌；1支置于28℃、1支置于37℃孵育，每周观察1次结果，同时记录罗氏培养基上菌落生长情况直至孵育4周。快速生长的非结核分枝杆菌1周左右可见菌落；缓慢生长的分枝杆菌4周报告结果。结核分枝杆菌复合群在28℃不生长。

    3．阳性对照菌株 堪萨斯分枝杆菌（M．kansasii）。

    4．阴性对照菌株 H37Rv。

    （三）耐热触酶实验

    多数非结核分枝杆菌（NTM）经68℃处理一定时间后，其过氧化氢酶仍保持活性，可分解过氧化氢。

    1．试剂

    （1）pH＝7．0、1／15mol／L PBS（无菌）。

    （2）30%H2O2（过氧化氢溶液）。

    （3）10%吐温80水溶液（121℃灭菌10min，4℃保存，2周内使用）。

    2．实验方法 取在L－J培养基上生长旺盛的细菌约5mg，放在装有1．5ml的PBS（pH＝7．0、1／15mol／L）试管中研磨成菌悬液；置于68℃水浴20min，取出后立即冷却；缓缓加入等量混合的30%H2O2和10%吐温80（临近使用前配制）反应液0．5ml。

    3．结果判定 有持续小气泡产生的为阳性；10～20min仍无气泡产生的为阴性；空白试剂对照无气泡产生。

    4．阳性对照菌株 堪萨斯分枝杆菌（M．kansasii）。

    5．阴性对照菌株 H37Rv。

    6．空白对照 pH＝7．0、1／15mol／L PBS（无菌）。

    三、结核分枝杆菌复合群菌种鉴定实验

    目前临床分离鉴定属于结核分枝杆菌菌群的菌株，结核分枝杆菌和牛型分枝杆菌占绝大多数。这两种分枝杆菌，需要同时采用下列实验进行鉴别区分，如噻吩－2－羧酸肼（TCH）培养基生长、硝酸还原实验、烟酸实验。

    （一）噻吩－2－羧酸肼（TCH）培养基生长

    一定浓度的TCH对牛型分枝杆菌和少部分结核分枝杆菌有抑制生长的作用；而对大部分结核分枝杆菌无抑制作用。

    1．培养基 TCH培养基（含5mg／ml TCH的罗氏培养基）1支，罗氏（L－J）培养基1支。

    2．实验方法 每支培养基接种0．001mg细菌；37℃孵育4周时观察结果，同时记录TCH培养基和罗氏培养基上菌落生长情况。大部分结核分枝杆菌TCH培养基和罗氏培养基上菌落的生长情况相同；牛型分枝杆菌在罗氏培养基生长良好，在TCH培养基上生长受到抑制。

    3．阳性对照菌株 H37Rv。

    4．阴性对照菌株 牛型分枝杆菌（M．bovis）。

    （二）硝酸还原实验

    结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌（NTM）能够产生硝酸盐还原酶，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐；在酸性条件下，亚硝酸盐与氨基苯磺胺、N－甲萘基乙烯二胺盐酸盐形成红色偶氮化合物。牛型分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌（NTM）因不能产生硝酸盐还原酶，故该实验阴性。因此本实验可用于结核分枝杆菌与牛型分枝杆菌的鉴别。

    1．试剂

    （1）硝酸盐溶液：NaNO3（0．085g）溶100ml PBS（pH 7．0、1／15Mol／L）内，121℃灭菌20min，每管分装2ml。

    （2）35%的浓盐酸等倍稀释。

    （3）0．2%氨基苯磺胺溶液（4℃保存，4周内使用）。

    （4）0．1%N－甲萘基乙烯二胺盐酸盐溶液（4℃可保存4周）。

    （5）锌粉：0．1g。

    2．实验方法

    （1）刮取3～4周菌龄、L－J培养基上生长旺盛的菌落约5mg。

    （2）置于装有2ml硝酸盐溶液试剂的试管中充分研磨并混匀，37℃水浴2h后取出。

    （3）加入1滴35%的浓盐酸试剂混匀。

    （4）加入2滴0．2%氨基苯磺胺溶液试剂混匀。

    （5）加入2滴0．1%N－甲萘基乙烯二胺盐酸盐溶液试剂混匀。

    3．结果判定 1min内呈红色为阳性；试剂混匀后1min内颜色无变化，加入0．1g锌粉混匀观察5min，颜色无变化者为强阳性，出现红色或淡红色者为真阴性；空白对照从无色变为红色。

    4．阳性对照菌株 H37Rv。

    5．阴性对照菌株 牛型分枝杆菌（M．bovis）。

    6．空白对照 pH＝7．0，灭菌的1／15mol／L PBS。

    （三）烟酸实验

    由于结核分枝杆菌缺乏烟酸酶，故不能分解代谢过程中产生的烟酸。在培养基中，结核分枝杆菌生长时的烟酸聚集量较牛型分枝杆菌及其他分枝杆菌高。烟酸吡啶核环的氮与联苯胺及溴化氰作用后，呈现桃红色或红色沉淀反应。但应注意，对INH高度耐药的结核分枝杆菌可能此实验为阴性，届时需结合硝酸还原实验结果判定。

    1．试剂

    （1）3%联苯胺乙醇溶液。

    （2）10%溴化氰溶液（剧毒！在通风橱内配制）。

    注意：上述试剂必须存放于褐色试剂瓶中，瓶口密封，4℃可保存2周。溴化氰溶液如发生沉淀，应在室温下溶解后使用。

    2．实验方法 取在罗氏培养基孵育4周且生长旺盛的1支培养管，将菌落用无菌吸管刮到培养基斜面一边，在暴露出的培养基斜面上加入2ml沸水，振荡数次后，将培养基平放在37℃孵箱中孵育30min（应注意使蒸馏水铺满斜面）。取浸提液0．8ml平分到2支试管中，各加入0．1ml的联苯胺乙醇溶液试剂，混匀后向其中1支试管中加入0．1ml的10%溴化氰溶液试剂，观察颜色变化。

    3．结果判定 加入两种试剂的试管内菌液呈现红色或桃红色沉淀为阳性；白色沉淀为阴性；空白试剂对照不变色。结果观察完毕后，加入4%NaOH溶液，加塞混匀后放置24h后方可消除溴化氰的毒性。

    4．阳性对照菌株 H37Rv。

    5．阴性对照菌株 牛型分枝杆菌（M．bovis）。

    6．空白对照 生理盐水。

    由于烟酸含量在2g以上才出现阳性结果，故培养基上生长的菌落数一般必须在50个以上，否则可能出现假阴性结果。

    由于临床分离的菌株生物特性不稳定，故对结核分枝杆菌菌群的分枝杆菌进行菌种鉴定时应至少同时使用上述3个鉴定实验中的2个，以便对结果进行综合判定（表2－10）。

表2－10 结核分枝杆菌菌群和NTM鉴别

    

d．部分阳性、部分阴性

    四、非结核分枝杆菌（NTM）菌群生长特征鉴定实验

    经菌群鉴定实验被划归为非结核分枝杆菌（NTM）菌群的分枝杆菌，如需进一步进行菌种鉴定，应首先进行生长特征鉴定实验。相关实验主要目的是观察分枝杆菌的生长速度、色素产生情况、菌落形态特征、在各种鉴别培养基上生长情况的结果，包括苦味酸培养基生长实验、5%NaCl培养基生长实验、谷氨酸钠葡萄糖琼脂培养基生长实验、麦康凯琼脂培养基生长实验等。

    （一）生长速度

    传代培养4周菌龄的非结核分枝杆菌（NTM）菌株，制备菌悬液并进行稀释；接种2支L－J培养基（0．001mg／支）后，分别置于28℃、37℃孵育；在3d和7d观察结果，以后每周观察1次。1周内生长菌落的为快速生长非结核分枝杆菌（NTM）；反之则为缓慢生长非结核分枝杆菌（NTM）。

    1．缓慢生长非结核分枝杆菌（NTM）对照菌株 堪萨斯分枝杆菌（M．kansasii）。

    2．快速生长非结核分枝杆菌（NTM）对照菌株 草分枝杆菌（M．phlei）。

    （二）色素产生

    传代培养4周菌龄的非结核分枝杆菌（NTM）菌株，制备菌悬液并进行稀释；接种4支L－J培养基（0．001mg／支）后，2支培养基以锡纸或黑纸包裹密封，另2支不包。将2支培养基（1支包纸和1支不包纸）在37℃培养，另2支于28℃培养。不包纸的培养基长出菌落时，打开2支包纸的培养管观察：有色素产生为暗产色菌；无色素产生者，放松胶塞进行通气，同时以100W钨灯近距离（灯至试管的距离≤50cm）照射3h，放置于原温度孵育3d，每日观察1次，产生色素者为光产色菌；不论光照与否，菌落均无色素产生者为不产色菌。

    1．光产色对照菌株 堪萨斯分枝杆菌（M．kansasii）。

    2．暗产色对照菌株 戈登分枝杆菌（M．gordonae）。

    3．不产色对照菌株 胞内分枝杆菌（M．intracellulare）。

    4．产色情况随培养温度变化的菌株 苏尔加分枝杆菌（M．szulgai）。

    （三）苦味酸培养基生长实验

    1．培养基成分 谷氨酸钠（0．4g）、枸橼酸钠（0．2g）、磷酸二氢钾（0．05g）、苦味酸（0．2g）、硫酸镁MgSO4·7H2O（0．05g）和甘油醇（3ml），溶解于97ml蒸馏水；以10%NaOH调pH 7．0～7．2，加琼脂3g，121℃灭菌20min，分装试管制成斜面使用。

    2．实验方法 接种0．1mg细菌至培养基斜面，37℃孵育2周。有菌落生长者为快速生长菌。龟分枝杆菌不生长；脓肿分枝杆菌生长；两者可依据此实验初步鉴别。

    （四）5%NaCl培养基生长实验

    1．培养基成分 罗氏培养基中按5%（W／V）加入NaCl。

    2．实验方法 接种0．001mg细菌，37℃培养；每周观察1次至4周。L－J培养基做对照管。对照管及实验管均有生长则为阳性；反之为阴性。快速生长菌不产色菌中龟分枝杆菌为阴性。

    （五）谷氨酸钠葡萄糖琼脂培养基生长实验

    1．培养基成分 谷氨酸钠（0．4g）、KH2PO4（0．05g）、MgSO4·7H2O（0．05g）溶于90ml蒸馏水以10%NaOH调pH 7．0～7．2，然后加蒸馏水至100ml，再加琼脂3g，121℃灭菌20min，按1%比例加入葡萄糖（注意无菌手续），分装试管制成斜面。

    2．实验方法 接种0．1mg细菌（以罗氏培养基为对照），37℃培养3周，观察结果；罗氏和琼脂培养基均有生长者为阳性。

    3．阳性对照菌株 胞内分枝杆菌（M．intracellulare）。

    4．阴性对照菌株 鸟分枝杆菌（M．avium）。

    （六）麦康凯琼脂培养基生长实验

    此实验主要用于快速生长菌的鉴别。

    1．培养基成分 不含结晶紫的麦康凯培养基制成平板。

    2．实验方法 接种0．1mg细菌，37℃培养5～11d（为保持平板湿度，可将平板放在铺有湿纱布的带盖容器中）。生长的菌落经抗酸染色确认。

    3．阳性对照菌株 偶然分枝杆菌（M．fortuitum）。

    4．阴性对照菌株 耻垢分枝杆菌（M．smegmatis）。

    五、非分枝杆菌菌种鉴定常用生化特征实验

    经菌群鉴定实验被划归为NTM菌群的分枝杆菌，在进行生长特征鉴定实验的同时，还应进行常用的生长特征鉴定实验，以进一步鉴定到种水平，相关的实验包括吐温80（Tween80）水解实验、尿素酶实验、芳香硫酸酯酶实验、铁离子吸收实验、亚碲酸盐还原实验等。

    （一）吐温80（Tween 80）水解实验

    某些分枝杆菌具有一种酯酶，可分解吐温80成为油酸等物质，使菌悬液的琥珀色变为紫红色。

    1．试剂 缓冲液PBS（pH7．0、1／15mol／L）100ml，加入0．5ml吐温80和0．1%中性红溶液2ml，121℃灭菌20min后，每管分装3ml。可4℃保存，限2周内使用。

    2．实验方法 用吸管挑取在罗氏培养基上生长旺盛的细菌约5mg，置于装有3ml试剂的试管中，37℃孵育10d。第3天、第5天、第10天观察结果。

    3．结果判定 菌悬液由琥珀色变为紫红色者为阳性；不变者为阴性；空白试剂对照不变色。

    4．阳性对照菌株 堪萨斯分枝杆菌（M．kansasii）。

    5．阴性对照菌株 瘰疬分枝杆菌（M．scrofulaceum）。

    6．空白对照 空白试剂。

    （二）素酶实验

    某些分枝杆菌产生尿素酶，可分解尿素使菌悬液呈红色。

    1．试剂

    （1）缓冲液PBS（pH6．7，1／15mol／L），121℃灭菌20min，4℃保存。

    （2）取试剂（1）配制0．12%尿素，以0．22μm滤膜除菌，每支试管分装3ml。

    （3）0．1%酚红：取酚红0．1g加NaOH（0．05mol／L）5．7ml溶解后，加水至100ml，113℃灭菌10min。

    2．实验方法 用吸管挑取在罗氏培养基上生长旺盛的细菌约5mg，移置于装有3ml试剂（2）的试管中，每管加入1滴试剂（3）；37℃孵育3d观察结果。

    3．结果判定 菌悬液呈红色者为阳性；不变色者为阴性；空白试剂对照不变色。

    4．阳性对照菌株 结核分枝杆菌（M．tuberculosis）。

    5．阴性对照菌株 蟾蜍分枝杆菌（M．xenopi）。

    6．空白对照 空白试剂。

    （三）芳香硫酸酯酶实验

    某些分枝杆菌产生硫酸芳香酯酶，能分解二硫酸酚酞三钾盐，游离出酚酞，在碱性环境下出现紫红色。

    1．试剂

    （1）含二硫酸酚酞三钾盐的培养基：二硫酸酚酞三钾盐（分子量610．34）61．0mg，加入100ml苏通液体培养基，混匀后121℃灭菌15min，每支试管分装2ml。

    （2）10．6%NaCO3水溶液。

    2．实验方法 取装有试剂（1）的试管2支，分别加入生长旺盛的细菌菌悬液（20～40mg／ml）0．5ml；37℃孵育的第3天、第10天，分别取1支试管加入0．5ml试剂（2）后，观察颜色变化。

    3．结果判定 菌悬液呈紫红色者为阳性；不变者为阴性；空白对照不变色。

    4．阳性对照菌株 偶然分枝杆菌（M．fortuitum）。

    5．阴性对照菌株 H37Rv。

    6．空白对照 空白试剂。

    （四）铁离子吸收实验

    某些分枝杆菌具有还原铁盐的能力。铁离子被吸收后；菌落呈铁锈色。

    1．试剂 4%枸橼酸铁胺溶液，121℃灭菌15min，每支试管分装1ml，4℃保存，3周内使用。

    2．实验方法 接种前弃去改良罗氏培养基管内凝固水，接种0．1mg生长旺盛的细菌，加入试剂1ml到培养基底部，37℃孵育3周，每周观察结果1次。未加试剂的罗氏培养基为对照。

    3．结果判定 菌落呈铁锈色者为阳性；不变色者为阴性。注意，与罗氏培养基上生长的菌落对比。

    4．阳性对照菌株 偶然分枝杆菌（M．fortuitum）。

    5．阴性对照菌株 龟分枝杆菌（M．chelonae）。

    （五）亚碲酸盐还原实验

    某些分枝杆菌可使碲盐还原为金属碲，使培养物呈黑色或深棕色沉淀物。

    1．试剂

    （1）0．2%亚碲酸钾溶液，121℃灭菌15min。

    （2）0．5%苏通琼脂培养基，121℃灭菌15min，每管分装3ml，制成斜面。

    2．实验方法 接种0．1mg细菌到试剂（2）培养基表面，37℃孵育7d时加入2滴试剂（1），再孵育3d观察结果。

    3．结果判定 有黑色或深棕色沉淀物为阳性；无沉淀物者为阴性；空白试剂对照无变化。

    4．阳性对照菌株 胞内分枝杆菌（M．intracellulare）。

    5．阴性对照菌株 次要分枝杆菌（M．triviale）。

    六、分枝杆菌菌种鉴定实验的质量控制

    所有进行菌种（菌群）鉴定的临床分离株，必须经过传代增菌，菌龄为3～4周且生长良好；所有实验涉及的培养基、试剂必须符合规定的使用期限；所有标明有对照的鉴别实验，在实施时参照系的结果符合相应标准后方可判定待测菌株的结果；进行相应实验时，应采取必要措施，注意防止菌株对操作人员、实验室和社会环境造成危害和污染。

    非结核分枝杆菌（NTM）菌株经过生长特性和生化特性鉴别实验后，结合菌种鉴定流程图和菌种鉴定实验对照表（表2－11）综合判定菌种鉴定结果。

    

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