任务6.2 酵母菌的形态观察及鉴别
酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1～5μm或5～20μm。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的真核细胞结构，有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。
大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖。酵母菌的无性繁殖以芽殖为主，也有少数是裂殖；有些酵母菌能产生子囊孢子，有的酵母菌能形成假菌丝。酵母菌的菌落近似细菌的菌落。但较大且厚，多呈白色，少数为红色。酵母菌在液体中生长可形成菌膜、菌环、沉淀和混浊。酵母菌的细胞形态、繁殖方式和培养特征均为菌种鉴定的依据。
在食品工业中，诸如啤酒、面包、白酒等生产过程中，酵母菌的应用不胜枚举。比如在啤酒生产过程中，酿造啤酒酵母的性能优劣，直接影响成品啤酒的质量。因此，啤酒酵母也被称为啤酒的灵魂，对于酿造过程的酵母性能进行监督检测，是生产过程中的一个重要环节。其中，酵母菌的形态观察是最直观、最快速地初步判断菌种生长是否异常的方法。
6.2.1 酵母菌的形态观察
酵母菌在麦芽汁培养基、葡萄糖、马铃薯培养基或其他营养丰富的人工合成培养基上生长时，利于菌体以出芽方式繁殖。所以，为方便对酵母菌形态的观察，本次实训我们选取麦芽汁培养基为培养基，也可以用半合成的马铃薯葡萄糖培养基或人工合成的YPD培养基来代替，具体选择可以实训室的条件来定。
1）实训目的
认识酵母菌的菌落特征及其在光学显微镜下的一般形态；熟悉显微镜的使用与操作；熟练掌握酵母菌水浸片的制片与观察。
2）实训器材
①菌株：酿酒酵母。
②培养基：麦芽汁培养基。
③仪器与设备：鼓风干燥箱、恒温培养箱、浅盘、波美比重计、高压灭菌锅、超净台、显微镜、载玻片、盖玻片、接种针、滴瓶（带胶头滴管）、三角瓶、纱布、试管、棉塞、吸量管、菜刀、烧杯、电炉。
3）实训步骤
（1）实验准备
①麦芽汁培养基的配制与灭菌。
a.取优质大麦或小麦若干，用水洗净后浸泡6～12h，置于深约2cm的木盘上摊平，15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。
b.取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3～4h，使其自行糖化，直至糖化完全。
c.取0.5mL的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全。
d.糖化液用4～6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用一个鸡蛋清，加水20mL，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤。
e.用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10～15波林，调pH值至6.4。也可用未经发酵、未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10～15波林后使用。
f.分装、加塞、包扎。
g.所需固体培养基，在已配制的液体培养基中加入2%琼脂即可。
h.配制好的培养基要立即进行高压灭菌，有关器具可一并进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为：121℃灭菌20min。
灭菌后的液体培养基用于酵母菌的活化培养及液体培养物制备，固体培养基灭菌后，在冷凝前趁热分装，部分装入大试管用于制备琼脂斜面（也可以灭菌前分装入试管，在温度降低但尚未凝固前摆放斜面）；另一部分趁热倒入平皿中，制备固体平板，用于酵母菌菌落特征的观察。
②酵母菌的活化培养。将甘油管保藏或斜面保藏的酵母菌，接入灭菌过的液体培养基后置于28℃培养箱活化培养48h，然后再接入新鲜的液体培养基中进行二次活化，制作种子发酵液。
③酵母菌液体培养物的梯度稀释。配制0.85%的生理盐水，并按照9mL的量分装于试管中，高压灭菌后备用。用制备好的酵母菌种子发酵液，按照图6.12所示方法进行梯度稀释，可分别获得10－1、10－2、10－3、10－4不同浓度的稀释液。
（2）酵母菌的固体培养
取稀释至10－3、10－4的酵母菌种子发酵液各0.2mL，在超净台上进行平板涂布，同时，用接种针蘸取未经稀释的种子发酵液，在已倒好的固体平板上划线。然后，将制好的固体平板在28℃培养箱中培养3～4d，观察菌落形态。
图6.12 梯度稀释的操作示意图
（3）酵母水浸片的制作与观察
①制片。
a.液体培养物：在干净的载玻片中央加一滴预先稀释至适宜浓度的酵母液体培养物，从侧面盖上一片盖玻片，应避免产生气泡，并用吸水纸吸去多余的水分。
b.固体斜面培养物：取0.85%生理盐水一滴，滴加在干净的载玻片中央，用接种环以无菌操作取琼脂斜面上培养48h左右的酵母菌体少许，在液滴中轻轻涂抹均匀，并加盖干净盖玻片。
②镜检。将制作好的水浸片置于显微镜的载物台上，先用低倍镜，后用高倍镜进行观察，注意观察各种酵母的细胞形态和繁殖方式，并进行记录。
4）注意事项
实训中有如下注意事项：
①在梯度稀释、水浸片制作时，均要求用灭菌过的0.85%的生理盐水代替无菌水使用，否则，由于渗透压的影响，将使酵母菌细胞发生形变，影响观察结果。
②酵母菌涂布平板的培养结果若长出的菌落相连成片，无单菌落，则表明稀释梯度不够，可增加1～2个稀释梯度再进行涂布；相反，若菌落稀少，可选择上一个浓度的稀释液进行涂布。
③制作水浸片时，所用的载玻片一定要干净无油脂，否则液滴涂布不均匀，会影响观察。
④盖上盖玻片时，先将盖玻片一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡。
⑤滴到载玻片上的酵母菌液不宜过多，否则，在盖盖玻片时，菌液会溢出或出现气泡而影响观察；菌液也不宜过少，否则，着色细胞数量少，涂抹效果差，细胞难以在载玻片上均匀分布，不利于镜检时酵母形态的观察。
⑥做好水浸片后马上观察，否则液滴容易风干，酵母菌容易失水变形或死亡。
5）实训结论
请绘图说明你所观察到的酵母菌形态特征。
（1）酵母菌的菌落特征
酵母菌的菌落（图6.13）与细菌菌落类似，但一般较细菌菌落大且厚，表面湿润，黏稠，易被挑起，多为乳白色，少数呈红色。
图6.13 几种典型的酵母菌菌落特征
（2）酵母菌的形态特征
如前所述，酵母的形态亦是多种多样，具体的形态特征要视所用菌株而定。有时候，同一菌株在生长过程中，受到不同培养基成分、培养条件等外界刺激时，也会表现出不同的形态特征。据此，我们还可以在生产中通过形态观察来判断生产菌株的活性、生长状态等。图6.14为芽殖酵母的形态结构示意图，图6.15为酿酒酵母的电镜照片。
图6.14 几种典型的酵母形态特征
图6.15 酿酒酵母的电镜扫描照片
6.2.2 酵母菌死、活细胞的鉴别
通过镜检，鉴别酵母菌株的死活细胞的数量与比例来判断生产菌株的活力，也是生产中常用的一种简单直接的方法。
美蓝又被称为亚甲基蓝或次甲基蓝，是一种弱氧化剂，氧化态呈蓝色，还原态呈无色。用美蓝对酵母细胞进行染色时，活细胞由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能将美蓝由蓝色的氧化态转变为无色的还原态型，从而细胞呈无色；而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则由于细胞内还原力较弱而不具备这种能力，从而细胞呈蓝色，据此可对酵母菌的细胞死活进行鉴别。
1）实训目的
掌握美蓝染色鉴别酵母菌死、活细胞的方法；能够运用镜检判断酵母菌种的活力。
2）实训器材
①菌株：酿酒酵母。
②培养基：麦芽汁琼脂培养基，美蓝染色液。
③设备与仪器：高压灭菌锅、超净台、显微镜、载玻片、盖玻片、接种针、滴瓶（带胶头滴管）、三角瓶、棉塞、滴管、大试管。
3）实训步骤
（1）实验准备
①实验器材的高压灭菌和麦芽汁琼脂斜面的制备。麦芽汁液体培养基的制备方法见实训6.1.2中麦芽汁培养基的配制，然后取一定体积已配好的液体培养基，加入2%琼脂，加热融化，补充失水，并分装入试管，和其他需要无菌操作的器具一并进行高压灭菌。灭菌条件为：121℃灭菌20min。
灭菌后的麦芽汁琼脂培养基，待其冷却凝固前将试管倾斜摆放，制成琼脂斜面。
②0.1%美蓝染色液的配制。用电子天平小心称取0.1g的美蓝染色剂，用蒸馏水溶解后定溶于100mL容量瓶中，得0.1%的美蓝染色液，储于带滴管的试剂瓶中备用。
（2）活化酵母
将酿酒酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上，培养24h，然后再转种到新鲜的麦芽汁琼脂斜面上2～3次，得酵母的活化培养物。
（3）美蓝染色
在干净的载玻片中央加一小滴0.1%美蓝染色液，然后再加一小滴预先稀释至适宜浓度的酿酒酵母液体培养物，混匀后从侧面盖上盖玻片，并吸去多余的水分和染色液。
（4）镜检
将制好的染色片置于显微镜的载物台上，放置约3min后进行镜检，先用低倍镜，后用高倍镜进行观察，根据细胞颜色区分死细胞（蓝色）和活细胞（无色），并进行记录。
（5）镜检结果比较
美蓝染色约30min后，再次镜检进行观察，注意比较死细胞数量是否增加，即被染成蓝色的细胞密度或一定范围内的个数是否增加。
4）注意事项
实训注意事项如下：
①染色时所取的酵母液体培养物一般为稀释10倍或100倍的酵母培养原液，可先做预实验，即用稀释10倍的发酵液染色、观察细胞密度，若细胞密度仍然过大，可以考虑用100倍的稀释液，过低则换用未经稀释的发酵原液。
②染色时注意染色液和菌液不宜过多或过少，并应基本等量，而且要混匀。
③涂片时动作要轻，以免操作过强引起细胞变形。
④染色完成后要立即进行观察，否则，死细胞数量会明显偏高。
5）实训结论
将观察到的结果记录如下表6.3。
表6.3 酵母菌死细胞、活细胞镜检登记表
在光学显微镜下，可以清晰地看到美蓝染色后的酵母细胞因其活性不同而呈现出不同的颜色（图6.16），分别用10倍镜、40倍镜和100镜观察，有条件可以对观察结果进行拍照记录。
图6.16 酵母菌染色后死活细胞在光学显微镜下的形态
6.2.3 酵母菌子囊孢子的染色与观察
单细胞的酵母菌个体是常见细菌的几倍甚至几十倍，大多数酵母菌的繁殖采取出芽方式（在营养丰富的培养基中）进行无性繁殖，也可以通过结合产生子囊孢子（营养贫乏的培养基中）进行有性繁殖。取活化好的酵母菌株，划线接种到醋酸钠琼脂斜面上进行培养，由于营养缺乏，一段时间后，大多数酵母菌处于饥饿状态下，无法良好地生长，从而促进其产生子囊孢子。
由于酵母菌孢子壁厚不易着色，但是一旦着色就很难被脱色。因此，先用强染色剂（孔雀绿）染色，使染料进入菌体和孢子，水洗时菌体中染色被洗脱而孢子中染料保留。在用对比度大的复染色剂染色后，菌体染上复染色剂的颜色而孢子保留原来颜色，这样可将两者区别开来。
1）实训目的
认识酵母菌子囊孢子形成的条件，观察酵母菌子囊孢子的形态；掌握酵母菌子囊孢子的染色与观察方法。
2）实训器材
①菌株：酿酒酵母。
②培养基：麦芽汁培养基、醋酸钠琼脂培养基（麦氏培养基）。
③试剂：5%孔雀绿染色液、0.5%的沙黄染色液或0.5%的番红染色液、95%乙醇。
④设备与仪器：鼓风干燥箱、恒温培养箱、浅盘、波美比重计、培养箱、水浴锅、纱布、电子天平、高压灭菌锅、超净台、显微镜、载玻片、盖玻片、接种针、滴瓶（带胶头滴管）、三角瓶。
3）实训步骤
（1）实验准备
①麦芽汁培养基的制备。方法见实训6.1.2中麦芽汁培养基的制备。
②酵母菌的活化培养。将甘油管保藏或斜面保藏的酵母菌接入灭菌过的液体培养基后置于28℃培养箱活化培养48h，然后再接入新鲜的液体培养基中进行二次活化，制作种子发酵液。
③醋酸钠琼脂斜面的制备。称取葡萄糖0.1g，氯化钾0.18g，酵母浸膏0.25g，琼脂2g（冬天可以将琼脂的量减少至1.8g），加热充分溶解后定容至100mL。可以趁热分装入大试管，包扎后立于灭菌锅中于121℃高压灭菌20min，灭菌后，待温度降至50℃左右但尚未冷凝时，摆放斜面。也可以先将配好的培养基进行高压灭菌后，再在冷凝前趁热分装入大试管，并立即摆放斜面。
④孔雀绿染色液和沙黄染色液的配制。小心称取2.5g孔雀绿染色剂，用蒸馏水定容至50mL，制得5%孔雀绿染色液，贮于50mL棕色带滴管的试剂瓶备用。称取0.5g沙黄（或番红）染色剂，用蒸馏水定容至100mL，制得0.5%沙黄（或番红）染色液，分别贮于50mL棕色带滴管的试剂瓶备用。
（2）酵母菌活化培养
将保藏的酿酒酵母接种至新鲜的麦芽汁培养基，28℃培养48h，然后再转种到新鲜的麦芽汁培养基，28℃、24h活化培养2～3次，得酵母的活化培养液。
（3）酵母菌的生孢培养
将经活化的酵母菌种转移到醋酸钠琼脂斜面培养基上，28℃培养7～10d，待孢子产生后使用。
（4）制片
在洁净载玻片的中央滴一小滴蒸馏水，用接种环于无菌条件下挑取少许菌苔至水滴上，涂布均匀，自然风干后在酒精灯火焰上热固定。
（5）染色
滴加数滴孔雀绿染色液，染色1min后用清水冲洗；然后加95%乙醇脱色30s，再用水冲洗；最后用0.5%沙黄染色液（也可以用0.5%的番红染色液代替）复染30s，再次水洗后，用吸水纸吸干。
（6）镜检（图6.17）
将染色片置于显微镜的载物台上，先用低倍镜，后用高倍镜进行观察，子囊孢子呈绿色，菌体和子囊呈粉红色。注意观察子囊孢子的数目、形状，并进行记录。
4）注意事项
①制片时，水和菌均不要太多，涂布时应尽量涂开，否则将造成干燥时间长；热固定温度不宜太高，以免使菌体变形。
图6.17 酵母菌子囊孢子染色（10×100）
②新鲜的培养基配制完成后，要立即进行高压灭菌，否则，会由于微生物的污染而改变培养基成分。
③乙醇脱色时间要控制好，不宜过长，且脱色后一定要用清水清洗干净后再加复染剂，否则可能使复染失败。
5）实训结论
请对你所观察到的结果进行绘图与描述，或者直接将观察到的结果进行拍照记录。
一般经染色处理后的酵母菌体和孢子囊呈红色，孢子呈绿色，可以看到几个孢子聚在一起，由红色孢子囊包裹。
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