酵母蛋白质和的提取

由 范文之家 分享时间：2023-06-09 12:35:35 加入收藏我要投稿点赞

酵母蛋白质和的提取

酵母蛋白质和的提取_生物化学实验技术

实验项目十五　酵母蛋白质和RNA的提取

学习目标

【知识目标】

（1）能用自己的语言描述酵母蛋白质和RNA提取的原理。

（2）能够迅速而准确地陈述酵母蛋白质和RNA提取的实验操作要点。

（3）能够准确鉴别酵母蛋白质和RNA提取的结果，并能说明其意义。

【能力目标】

（1）能够正确完成酵母蛋白质和RNA提取的各项操作内容，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。

（2）能够正确分析酵母蛋白质和RNA提取的结果。

案例引导

患者，男，42岁，近期出现全身乏力、食欲减退、恶心、呕吐、厌油、腹胀、肝区痛、尿色加深等症状。肝功能检查ALT升高。HCV－RNA检查呈阳性。根据所学知识，对患者作出诊断。

（提示：急性丙型肝炎）

【实验原理】

酵母细胞富含蛋白质和核酸。用稀碱液（0.2%的氢氧化钠）处理酵母细胞使细胞裂解，离心收集上清液，得到酵母核蛋白提取液。用盐酸调节提取液的pH值至3.0（核蛋白的等电点），核蛋白溶解度下降导致大量析出，离心收集沉淀物为酵母蛋白质粗制品。

酵母核蛋白是一种结合蛋白质，是蛋白质与核酸的复合物。酵母核酸主要是RNA（含量为干菌体的2.67%～10.0%），DNA含量较少，仅为0.03%～0.516%。如设法使酵母核蛋白中的蛋白质与核酸分离并除去蛋白质和DNA，就可得到较纯的RNA制品。这可通过以下操作完成：将核蛋白制品溶于含十二烷基磺酸钠（SDS）的缓冲液中，加等体积的水饱和酚，剧烈振荡后离心，将溶液分成两层，上层为水相，含有RNA；下层为酚相，变性蛋白及DNA存在于酚相及两相界面处。吸出水相并加乙醇即可沉淀出酵母RNA。若用氯仿－异戊醇进一步处理RNA制品，则可获得纯度更高的RNA。

【实验器材】

离心机，干燥箱，恒温水浴箱，真空干燥器，天平，751型分光光度计，冰箱，量筒（50mL），蒸发皿，烧杯（50mL、100mL），Eppendorf管（1.5mL），精密试纸（pH值测定范围为0.5～5.0）。

【药品及试剂】

0.2%NaOH溶液，6mol/L盐酸溶液，95%乙醇，SDS缓冲液：0.3%SDS，饱和酚液，氯仿－异戊醇液，含2%乙酸钾的95%乙醇溶液，无水乙醇，乙醚，鲜酵母或干酵母粉。

【试剂配制】

（1）SDS缓冲液：0.3%SDS，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L乙酸钠，用乙酸将pH值调到5.0。

（2）氯仿－异戊醇液：24∶1（体积比）。

操作流程

【操作步骤】

1.酵母核蛋白的提取

称取鲜酵母30g或干酵母粉5g，放入100mL的烧杯中。加入40mL 0.2% NaOH溶液，在20～40℃水浴环境下搅拌30～60min后，在转速为4000r/min条件下离心10min，取上清液倒入50mL的烧杯中，并将烧杯置于放有冰块的250mL的大烧杯中冷却，待冷却至10℃以下时，用6mol/L HCl小心地调节溶液的pH值至3.0左右。随着pH值下降，溶液中的白色沉淀物逐渐增加，到pH值为等电点时沉淀最多（注意严格控制pH值）。pH值调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。将此悬浮液以3000r/min的转速离心20min，倒掉上清液。将沉淀物转入蒸发皿内，放入干燥箱中干燥后称重，即是酵母核蛋白粗品。

2.苯酚法提取酵母RNA

取上述核蛋白研碎，加10mL SDS－缓冲液，使之成匀浆，倒入Eppendorf管（略少于管容积的一半），室温下静置10min，再加等体积的饱和酚液，室温下剧烈振荡5min后置于冰浴中分层，在转速为4000r/min的条件下离心10min，吸出上清液，转入新的Eppendorf管，加两倍体积95%乙醇（含2%乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA沉淀。再以10000r/min的转速离心5min，弃去上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，各迅速离心1min，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录（或将沉淀溶于少量1mol/L NaCl溶液中，4℃时保存备用）。

【实验数据处理及结果分析】

1.计算核蛋白提取率

核蛋白提取率（%）＝核蛋白质量（g）/酵母质量（g）×100%

2.RNA含量测定

将干燥后或保留沉淀的RNA配制成浓度为10～50μg/mL的溶液，在751型分光光度计上测定其260nm处的吸光度，按下式计算RNA含量：