细胞活性测定

由 范文之家 分享时间：2023-05-12 16:30:32 加入收藏我要投稿点赞

细胞活性测定

实验6　NK细胞活性测定

(Determination of NK cell activity)

【目的】

了解NK细胞活性测定的常用方法及其实际意义。

目前国内外多采用检测NK细胞活性来研究不同疾病状态下NK细胞的杀伤功能。体外NK细胞活性测定的方法较多，常用的有形态学方法、同位素释放法、酶释放法、特异性荧光染料释放法、MTT比色法以及流式细胞术等。在此介绍几种常用的方法。

一、同位素释放法——⁵¹Cr释放试验

【原理】

能进入到增殖的细胞内，与细胞浆蛋白质牢固地结合。当标记的⁵¹Cr细胞受到损伤或死亡之后，即可释放出⁵¹Cr。⁵¹Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清液中的⁵¹Cr，即可计算出NK细胞活性。

【材料】

1.铬酸钠():⁵¹Cr的物理半衰期为27.72d。

2.十二烷基硫酸钠(SDS):用无菌生理盐水配制成2％浓度。

3.靶细胞:检测人的NK细胞活性常用的靶细胞为体外传代白血病细胞株K562。检测小鼠NK细胞活性常用的靶细胞是YAC-1细胞株。实验时一般采用24～48h培养的靶细胞。

4.效应细胞:从人外周血(肝素抗凝)分离的单核细胞或小鼠脾细胞。

5.含15％NCS的RPMI1640营养液及淋巴细胞分层液等。

【方法】

1.靶细胞的制备:取培养24～48h的靶细胞2×10⁶/5ml，加入100～200μci⁵¹Cr，置37℃水浴90min，每间隔15min振摇一次。然后用含5％NCS的RPMI1640培养液洗涤3次，除去游离的⁵¹Cr。计数活细胞，用完全RPMI1640培养液调整细胞浓度至1×10⁵/ml，如暂时不用，可放置4℃冰箱内保存。同时应检测细胞的⁵¹Cr标记率，一般要求标记率＞0.1cpm/细胞。

2.效应细胞的制备:常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞，用完全RPMI1640培养液配制成1×10⁷/ml的细胞悬液备用。

3.效-靶细胞作用:在无菌操作条件下，取效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100∶1)，加入96孔培养板内，每份标本做3个复孔。同时设自然释放对照孔(0.1ml靶细胞＋ 0.1ml完全RPMI1640培养液)和最大释放孔(0.1ml靶细胞＋0.1ml2％SDS)，放置37℃、5％CO₂温箱内孵育4h，取出后用微量移液器吸出各孔上清液0.1ml，加于小塑料试管内(勿将细胞吸出)，用γ-计数仪测量cpm值。

【结果】

根据下式计算⁵¹Cr自然释放率和NK细胞活性:

注:一般要求⁵¹Cr自然释放率＜10％。

二、乳酸脱氢酶释放试验

【原理】

乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一，在正常情况下，不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD^＋)变成还原型辅酶I(NADH₂)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基类化合物，在490nm或570nm波长处有一高吸收峰，利用读取的OD值，经过计算即可得知NK细胞活性。

【材料】

1. LDH底物溶液(临用前配制):硝基氯化四氮唑蓝(NBT) 4mg、氧化型辅酶I 10mg、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS) 1mg，加蒸馏水2ml溶解，混匀后取上液1.6ml加1mol/L乳酸钠0.4ml，然后加入0.1mol/L pH7.4PB至10ml。

2. 1％NP-40:用RPM I 1640培养液配制。3. 1mol/L柠檬酸终止液。

【方法】

1.靶细胞制备:取培养24～48h的靶细胞，洗涤3次，最后用完全RPM I 1640培养液调整细胞浓度至1×10⁵/ml，备用。

2.效应细胞的制备:常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞，洗涤3次，最后用RPM I 1640培养液调整细胞浓度至1×10⁷/ml。

3.效-靶细胞作用:将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T= 100∶1)加入40孔细胞培养板的孔，每份标本设3个复孔，同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组(0.1ml靶细胞＋ 0.1ml1％NP-40液)，低速离心1000r/min，2min后，置37℃、5％CO₂温箱中孵育2h。

4.酶促反应:取出培养物，吸取各孔上清液0.1ml于另一培养板孔中，置37℃预温10min，每孔加入新鲜配制的底物溶液0.1ml，室温避光反应10～15min。每孔加入1mol/L柠檬酸终止液30μl，以终止酶促反应。

【结果】

用酶联检测仪在570nm波长下读取各孔OD值，并计算NK细胞活性。