第六节 细胞的冻存与复苏
为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。
复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入45℃水中，使之在1min内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
冻存时保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
一、细胞的冻存
（一）仪器、用品与试剂
细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0．02%EDTA的0．25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10%FBS的RPMI 1640）等。
（二）操作步骤
1．取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。给每个培养瓶中加入1～2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。
2．待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3～5ml细胞培养基终止消化。
3．700～800r/min（约200g）离心5min，收集细胞沉淀。
4．加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1×106～10×106个/ml。
5．将上述细胞悬液分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。
6．置4℃普通冰箱中预冷30min。
7．将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。
8．次日将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。
（三）注意事项
1．冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24h内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。
2．冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5%～20%之间调整。
3．最好在冻存后的数天里任意选取一支所冻存的细胞进行复苏，用以鉴定冻存效果。
4．DMSO有毒，应戴手套操作；将冻存管放入液氮罐中时，应防止被溅出的液氮冻伤。
二、细胞的复苏
（一）仪器、用品与试剂
37℃水浴锅、离心机、离心管、培养瓶、细胞培养箱、倒置显微镜、吸管、废液缸、细胞培养基、70%乙醇浸过的棉球等。
（二）操作步骤
1．准备工作：开启恒温水浴锅，将温度调节在45℃。
2．从液氮罐中取出冻存管，立即放入水浴锅中摇晃，快速融化冻存液。
3．用乙醇棉球擦洗冻存管外部以降低污染机会。
4．打开冻存管，将冻存液转移到预先加入有培养基的离心管中，700～800r/min离心5min。
5．小心弃掉上清液，加入5ml左右培养液重悬细胞。
6．将所得细胞悬液转移入培养瓶中，盖上瓶塞，置培养箱培养。
（三）注意事项
1．冻存液融化要迅速。
2．洗涤的次数可适当增加，以尽可能去除冻存液成分的残留。
3．离心速度不宜太高，避免对细胞的损伤。
