实训十 间接酶联免疫吸附试验
一、目的要求
掌握间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）的操作步骤与结果判定方法。
二、仪器及材料
猪瘟病毒、待检猪血清、猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清、HRP-兔抗猪IgG、酶标板、酶联检测仪、温箱、微量移液器、吸头、包被液、洗涤液、封闭液、底物液、终止液等。
三、方法与步骤
（一）操作方法
1.抗原包被：用包被液将抗原（猪瘟病毒）稀释到1～10ug/mL，每孔uL 加入酶标板中，4℃过夜或37℃作用2～3h。
2.洗涤：甩干孔内液体，用洗涤液注满各孔，室温静置3min，倾去洗涤液，反复3次，拍干。
3.封闭：每孔加入200uL封闭液，置37℃温箱孵育2h。
4.洗涤：同步骤2。
5.加一抗（待检血清）：将待检血清编号后用PBS做1∶40倍稀释，每孔加uL，同时设立标准阴、阳性血清对照，置37℃作用1h。
6.洗涤：同步骤2。
7.加二抗（辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG）：用PBS将酶标抗体稀释至工作浓度，每孔加100uL，置37℃作用1h。
8.洗涤：同步骤2。
9.显色：每孔加新鲜配制的底物溶液100uL，置37℃避光作用15min。
10.终止反应：每孔加终止液50uL（勿倾去孔内液体）。
11.测定：在酶标仪上读取光密度（OD）值。以四甲基联苯胺（TMB）底物显色（硫酸终止）时，选用450nm波长；以邻苯二胺（OPD）底物显色（硫酸终止）时，选用490nm波长。
（二）结果判定
试验结果可用肉眼判断，也可用酶标仪检测。每次试验均须设标准阴、阳性血清对照。
肉眼观察时，若样本孔颜色深于阴性孔，可判为阳性。
酶标仪检测结果可按如下方法表示：
1.用阳性“＋”与阴性“－”表示：若样本的OD值超过规定吸收值判为阳性，否则为阴性。（规定吸收值=一组阴性样本的OD值之均值＋2倍或3倍SD，SD为标准差）
2.以P/N比值表示：样本的OD值与一组阴性样本的OD值均值之比即为P/N值。若样本的P/N比值大于1.5、2或3倍，即可判为阳性。
市售的ELISA试剂盒内有详细的说明书，具体操作及结果判定可按说明书进行。
【知识链接】
ELISA用液的配制。
1.0.01mol/LpH7.4PBS：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，无水Na2HPO41.15g或Na2HPO4·12H2O2.9g，KCl0.2g，加蒸馏水溶解后定容至1000mL。
2.包被液（0.05mol/LpH7.6碳酸盐缓冲液）：Na2CO31.59g，NaHCO3z.93g，加蒸馏水溶解后定容至1000mL，4℃保存。
3.洗涤液（0.05％的PBS-T）：0.01mol/LpH7.4PBS1000mL，Tween-200.5mL。
4.封闭液：于洗涤液中加入10％的小牛血清、5％的脱脂奶粉或1％明胶。
5.pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液：
甲液（0.1mol/L柠檬酸溶液）：柠檬酸21.01g，蒸馏水1000mL。
乙液（0.2mol/L磷酸氢二钠溶液）：无水Na2HPO48.4g（Na2HPO4·12H2O71.64g或Na2HPO4·2H2O35.61g），蒸馏水1000mL。
取甲液243mL，乙液257mL混合即成。
6.底物液（现用现配）：四甲基联苯胺（TMB）50mg溶于50mL磷酸-柠檬酸缓冲液中，临用前加30％H2O250uL即成。
或：邻苯二胺（OPD）40mg溶于100mL磷酸-柠檬酸缓冲液中，临用前加30％ H2O2150uL即成。
7.终止液（2mol/LH2SO4）：浓硫酸22.mL缓缓加入177.mL蒸馏水中混匀即成。
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