免疫胶体金技术

由 范文之家 分享时间：2022-10-14 00:35:56 加入收藏我要投稿点赞

免疫胶体金技术

（一）概述

金免疫技术是一种以胶体金作为标记物的免疫标记技术，最早是在1971年由Fauld和Taylor创立，应用胶体金标记抗沙门杆菌血清，并在电镜下看到在细菌抗原－抗体结合部位上的胶体金颗粒。该技术是以胶体金作为示踪标志物，利用特异抗原抗体反应，通过胶体金颗粒来放大免疫反应系统。最初用于免疫电镜技术，后来陆续建立了间接免疫金技术、免疫金银技术、彩色免疫金银技术、胶体金免疫层析技术等。由于检测时间短、试剂和样本用量少，胶体金技术在生物学各个领域得到了日益广泛的应用。

【基本概念】

1．溶胶　是指一种物质以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。被分散的物质叫分散相，容纳分散相的另一种物质称为分散介质。根据分散相颗粒的大小不同，可将分散相分为三种。

（1）粗分散体系：由多种分子组成，不稳定，常因重力而自动沉降，外观浑浊而不透明；

（2）胶体分散体系：分散相粒子直径在1～100nm，不易受重力影响，但有聚结变大的倾向，外观透明；

（3）低分子－离子分散体系：分散相粒子直径＜1nm，具有高度稳定性，不受重力影响。

2．胶体金　是指金的水溶胶，属于胶体分散体系，是指金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶。它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性没有明显影响。与其他标记物相比，胶体金具有以下特点。

（1）对组织细胞的非特异性吸附作用小。

（2）既可用于光镜，也可用于电镜。

（3）可以标记多种生物大分子，如多肽、免疫球蛋白、多糖、凝集素等，而不影响其生物活性。

（4）本身具有橘红色，可用光镜直接观察。

（5）灵敏度高、操作简便、保存时间长。

【基本原理】　胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固地结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其他生物大分子结合，根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

免疫金标记技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在电子显微镜下可见黑色的金颗粒；在光学显微镜下，则呈现红色或粉红色颗粒，因而可进行定性或半定量的免疫检测研究。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色法。

【制备过程】　根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法有枸橼酸三钠还原法和鞣酸－枸橼酸钠还原法。

1．枸橼酸三钠还原法

（1）10nm胶体金粒的制备：取0．01%HAuCl4水溶液100ml，加入1%枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。

（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0．01%HAuCl4水溶液100ml，加入1%枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15～30min，直至颜色变红。冷却后加入0．1mol／L　K2CO30．5ml，混匀即可。

（3）15nm、18～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0．01%HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1%枸橼酸三钠水溶液4ml、2．5ml、1ml或0．75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm。

2．鞣酸－枸橼酸钠还原法

（1）A液：1%HAuCl4水溶液1ml加入79ml双蒸水中混匀。

（2）B液：1%枸橼酸三钠4ml，1%鞣酸0．7ml，0．1mol／L　K2CO3液0．2ml，混合，加入双蒸水至20ml。

（3）将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色暎此法制得的金颗粒的直径为椀旑旐暎

注意事项

棬棻棭玻璃器皿必须彻底清洗棳最好是经过硅化处理的玻璃器皿棳否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性棳不能获得预期大小的金颗粒暎棬棽棭试剂配制必须保持严格的纯净棳所有试剂都必须使用双蒸水或三蒸水并去离子后配制暎棬棾棭配制胶体金溶液的旔斎以中性棬旔斎椃灡棽棭较好暎棬棿棭氯金酸的质量要求上乘棳杂质少暎最好是进口的暎棬椀棭氯金酸配成棻棩水溶液在棿曟可保持数月稳定棳由于氯金酸易潮解棳因此在配制时棳最好将整个小包装一次性溶解暎棬二棭胶体金蛋白标记

基本原理

暱胶体金蛋白标记棳实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程暎其原理一般认为是当蛋白质处于旔斎等于或稍偏碱于其等电点时棳呈电中性棳此时棳蛋白质分子的表面张力大棳与胶体金静电作用较小棳蛋白质较易吸附于金颗粒的表面棳而后形成一个蛋白层棳能够阻止胶体金颗粒的相互接触棳从而使金颗粒处于稳定状态暎"暰主要特点暱胶体金标记蛋白质能否成功的关键取决于旔斎暎用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径暍也就是不同颜色的胶体金颗粒暎这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能棳可以与葡萄球菌斄蛋白暍免疫球蛋白暍毒素暍糖蛋白暍酶暍抗生素暍激素等非共价结合棳因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具暎

标记步骤

棬棻棭确定蛋白质的最适稳定量及最佳旔斎暎棬棽棭以胶体金为标准棳确定所需要的待标记蛋白质的总量暎棬棾棭调整胶体金溶液旔斎至超过斝斏值棸灡椀暎棬棿棭在电磁搅拌下棳将蛋白质溶液加入胶体金溶液中棳加入蛋白质时应逐滴加入暎棬椀棭在磁性搅拌下加入椀棩的牛血清白蛋白使其终浓度为棻棩棳或加入棾棩聚乙二醇使其终浓度为棸灡棸椀棩暎棬椂棭将标记好的胶体金装入透析袋中浓缩后纯化保存暎

质量鉴定胶体金蛋白结合物的质量鉴定方法如下暎

棻灡胶体金颗粒平均直径的测量用支持膜的镍网棬铜网也可棭蘸取金标蛋白试剂棳自然干燥后直接在透射电镜下观察暎或用醋酸铀复染后增加组织的对比反差再观察暎计算棻棸棸个金颗粒的平均直径暎

棽灡胶体金溶液的斚斈椀棽棸旑旐值测定胶体金颗粒在波长椀棻棸暙椀椀棸旑旐出现最大吸收值峰暎用棸灡棸棽旐旓旍棷斕旔斎椄灡棽斝斅斢液棬含棻棩斅斢斄棳棸灡棸棽棩斘斸斘棾棭将胶体金蛋白试剂作棻暶棽棸稀释棳斚斈椀棽棸旑旐应该在棸灡棽椀左右暎一般应用液的斚斈椀棽棸旑旐应为棸灡棽暙棸灡棿暎

棾灡金标记蛋白的特异性与敏感性测定采用微孔滤膜免疫金银染色法棳将可溶性抗原棬或抗体棭吸附于载体上棬滤纸暍硝酸纤维膜暍微孔滤膜棭棳用胶体金标记的抗体棬或抗原棭以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体棳对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定暎

（三）常用染色方法

★免疫金法

【基本原理】　首先用特异性抗体（一抗）与抗原结合后，然后用胶体金标记的二抗与一抗反应，形成抗原－抗体－金标抗体复合物，在光镜下呈红色颗粒状。

【主要特点】　本法于1978年首次由Geoghengan等应用于检测B淋巴细胞表面抗原，本法要求金标抗体浓度高，因此，价格昂贵，既不经济也不够敏感。

【染色步骤】

（1）切片常规脱蜡入水。

（2）0．1%胰蛋白酶消化10min。

（3）双蒸水洗2次，每次5min。

（4）0．05mol／L（pH　7．4）TBS洗10min。

（5）1%卵蛋白封闭15min，不洗。

（6）滴加特异性一抗，4℃过夜或37℃1h。

（7）0．02mol／L（pH　7．4）TBS（内含0．1%牛血清白蛋白），洗3次，每次5min。

（8）1%卵蛋白封闭15min，不洗。

（9）胶体金标记SPA室温孵育1～2h。

（10）0．02mol／L（pH　7．4）TBS洗3次，每次5min。

（11）双蒸水洗2次，每次5min。

（12）1%戊二醛10min。

（13）蒸馏水洗2次，每次5min。

（14）伊文斯蓝染色、50%缓冲甘油封片。

★免疫金银法

【基本原理】　用还原剂对苯二酚将银离子（Ag＋）还原成银原子（Ag），被还原的银原子沉积在金颗粒周围形成“银壳”。“银壳”本身具有催化作用，促使更多的银离子还原并促进“银壳”越长越大，最终形成在光镜下就能看到黑褐色物质，标记出组织中抗原的部位。

【主要特点】　免疫金银法（Immunogold－silver　method，IGSM）在免疫金染色的基础上发展而来，近年来又不断改进，已成为最为灵敏而又经济的方法之一。本法只有在抗原存在的情况下，才有金颗粒并促使银壳的形成。没有抗原区域就没有抗原－抗体反应，也就不会有颗粒存在。这种方法显著提高了灵敏度，金标记抗体可以稀释10倍以上使用。

【主要优点】

（1）敏感性高、特异性强，目前认为它比PAP法灵敏度高20倍左右，背景较低，阳性产物易辨认。

（2）应用范围广，可以应用于冷冻切片、细胞涂片、培养细胞、石蜡切片进行光镜观察，而且还能用于透射电镜观察。

（3）定位准确，银颗粒沉积在抗原抗体反应部位，一般无扩散。

（4）方法简便、安全、经济，同时切片也可以长期保存。

【染色步骤】

（1）切片常规脱蜡入水。

（2）Lugol液，5min。

（3）5%硫代硫酸钠水溶液脱碘，5min。

（4）双蒸水冲洗3次，每次5min。

（5）0．05mol／L（pH　7．4）TBS液冲洗2次，每次5min。

（6）0．1%胰蛋白酶消化10min。