实训九 琼脂扩散试验
一、目的要求
掌握琼脂扩散试验的操作方法和判定标准。
二、仪器及材料
优质琼脂粉、平皿、打孔器、鸡传染性法氏囊抗原、阳性血清、阴性血清、待检血清、微量移液器、吸头等。
三、方法与步骤
（一）操作方法
1.琼扩板的制备：称取1g琼脂粉，加至100mL8.5％的高渗盐水（除禽类的检测外，对其他动物检测时用生理盐水配制）中，煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至55℃左右时倒入平皿，厚约3mm。
2.打孔：待琼脂凝固后，如图10所示，在琼脂凝胶上打梅花孔，孔径为mm，中间孔和周围孔间的距离大约为3mm，用牙签或针头挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔的边缘。
3.封底：将琼脂板底部在酒精灯火焰上轻轻拖过，至手背感觉微烫即可。
4.加样：中心孔加抗原，周围孔加被检血清，同时设一个阳性血清对照孔和一个阴性血清对照孔。各孔内滴加液体（血清或抗原）的量为满而不溢。每加一个检样均须更换吸头。
图10 打孔示意图
若检测抗血清的效价，抗原加中心孔，抗血清做2倍倍比稀释后置周围孔，以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该血清的琼扩效价。
5.反应：加样完毕后，静置10min，将琼扩板放湿盒内置37℃温箱中反应，分别在24h、48h和72h观察并记录结果。
（二）结果判定
1.判定方法：将琼脂板置暗背景或侧强光照射下观察。标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验可以成立；若无沉淀线或不明显，则不成立，应重做。
2.判定标准：
（1）被检血清与抗原孔之间出现明显清晰白色沉淀线，并与标准阳性血清孔的沉淀线相接者，判为阳性，记作“＋”。
（2）抗原与标准阳性血清孔之间的沉淀线端部向被检血清孔的内侧弯曲，而被检血清孔与抗原之间不形成完整的沉淀线，则为弱阳性。凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性反应者，判为阳性，记作“＋”。
（3）被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线，标准阳性血清与抗原孔之间沉淀线直伸到毗邻的被检血清孔边缘无弯曲者，判为阴性，记作“－”。
（4）抗原孔与被检血清孔之间沉淀线粗而混浊，或与标准阳性血清和抗原孔间的沉淀线交叉并直伸被检血清孔边缘者，则为非特异反应应重试，若仍出现非特异反应则判为阴性。
