三、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)
聚合酶链反应是一项能把靶DNA量扩增百万倍或更多的技术，它彻底改革了分子生物学的方法学。PCR在1985年首次被发现，现在已成为包括与环境微生物学相关的许多生物学实验室的重要实验方法。可以扩增环境中少量的DNA这一能力使检出非常灵敏。例如，用传统的培养技术检出1g土壤中的100个沙门氏菌细胞会非常困难，然而把100个细胞扩增成百万个细胞可使检出容易得多。
1.PCR的多种方法
(1)特异基因的PCR(PCR detection of a specfic gene)
根据特异序列设计的引物可以用来捡出所需基因，如根瘤菌属所有种的nod基因。PCR也能用于检出所有真细菌中普遍存在的16S核糖体基因保守序列。这一序列的外部高度保守，而内部顺序对于每一特定细菌是独特的。用这一通用序列设计引物进行扩增后，其产物的内部顺序可用于系统发育分析，鉴定一个特异的分离菌。研究者可以提取环境样品中细菌种群的群集DNA，扩增抽提出的DNA中细菌基因组的16S区段，用鸟枪法克隆这一PCR产物，随后分析克隆的序列。或者，在序列分析前用变性梯度凝胶电泳分离不同的PCR的产物。
(2)反转录酶PCR(reverse transcirtase-PCR，RT-PCR)
RT-PCR的关键是产生所需RNA序列的DNA拷贝(图15-6)，这个拷贝称为互补DNA或cDNA。这个反应的关键酶是反转录酶，这是一种依赖RNA的DNA聚合酶，用于从RNA模板合成DNA。RT-PCR的第一步是利用下游反义探针(它有与RNA互补的序列)或者随机6碱基顺序(小的约6 bp随机引物)来生产RNA分子的完整c DNA拷贝。这样，c DNA分子成了RNA链的补充链，正常的PCR就可进行了。在第一个循环中，与这一c DNA互补的DNA链被合成。这以后，PCR就像以前一样从双链DNA分子模板继续进行下去。
RT-PCR在环境微生物学已经用于检出RNA病毒、mRNA转录物和rRNA序列。
(3)综合细胞培养PCR(integrated cell culture-PCR，ICC-PCR)
综合细胞培养PCR是用病毒的纯培养物或环境的等分样品接种正规的细胞培养瓶，保温培养2～3d。保温培养后冷冻培养瓶，使细胞溶解，释放出病毒粒子。然后将RT-PCR应用于细胞培养物裂解液。实质上，这是在生物扩增后紧跟着酶促扩增，这种方法只要3天就可鉴别病毒，而单独的细胞培养需要10～15天。因此，这项技术大大提高了捡出病毒的速度(表15-8)。它还具备其他一些重要的优越性。因为病毒的生长先于PCR扩增，所以只有感染的病毒才能被检出。另外，ICC-PCR的灵敏性比直接的RT-PCR好，这是因为加到细胞培养物中的样品量可以大一些。细胞培养物中样品的稀释同样也稀释了任何可能存在于环境样品中的PCR抑制物质。最后，因为ICC-PCR阳性样品是通过PCR验证的，所以没有必要像细胞培养阳性那样去进行另外的细胞培养试验来确证阳性反应。这样，总的花费减少约50%。
图15-6 RNA的RT-PCR扩增
(4)半嵌套式PCR和多重PCR(seminested and multiplex PCR)
有时PCR反应可以用两个以上的引物，半嵌套式PCR就使用3个引物。先用两个引物检出一个特定基因(图15-7)，然后在第二轮PCR中使用补加试剂、一个原来的下游引物和一个新的与原来的PCR产物的内部序列互补的内部引物。这个第二轮PCR不仅可提高反应的灵敏度，而且能通过产生比原来产物小和依据内部序列的第二产物来确证第一轮扩增产物。
表15-8 病毒检出方法的比较
图15-7 半嵌套式PCR
两个外部引物和一个内部引物产生两种不同大小的产物。
多重PCR是一个反应中使用几套引物以产生几条鉴别性的电泳带(图15-8)。使用多套引物的一个目的就是能检出基因组的多重区段。例如，为了确证用lamβ基因的引物检出的大肠杆菌也携带毒素基因，可用lamβ基因和这个毒素基因二者的引物来建立一个PCR反应。多重PCR还可用于检出一个样品中多种机体的多重基因组，例如对自来水可检测含多种病原体。但是，特别要注意建立起来的多重反应必须有平衡的引物套数比率，这样才能得到正确有效而明确具体的结果。
图15-8 (a)多重PCR图解，其中多套引物能同时扩增多个序列;(b)多重PCR扩增的凝胶图解。这里用3套引物扩增沙门氏菌属一些种相关的3个序列，能检出病原体。［引自Way et al．，1993］
实际上这二种PCR方法使研究者能以单个实验回答多个问题。半嵌套式PCR能以一次试验鉴别和确证PCR产物，而多重PCR能以单一反应鉴别多个序列。
(5)PCR指纹法(PCR fingerprinting)
对一个特定细菌分离菌相关的各种大小DNA的多重片段进行扩增，电泳分离和染色就会产生一个DNA指纹。指纹分析有助于鉴别和区分环境中的微生物分离菌。PCR指纹法依赖于那些与DNA序列退火的引物，这些DNA序列在染色体全长多个位置上重复出现。有一种PCR指纹法是任意引物PCR(AP-PCR)，又称为随机扩增多态DNA(RAPD)。AP-PCR使用一个长10～20bp的随机引物在低温下退火，导致一个基因的非特异性扩增(图15-9)。这种反应在事先不知道序列信息的情况下会根据一个种基因组的独特性产生一种指纹。依据所用的随机引物，指纹带型可能简单(1～2个带)，也可能复杂(＞10个带)。其他的指纹法包括基因外重复回文序列PCR(RER-PCR)，它以ERP序列、ERIC(肠细菌基因间重复共有区)序列或BOX序列为目标。这些序列元件在原核基因组中到处都有，它们是非编码区的短的(＜160bp)反向重复序列，可能与拟核的组织结构有关。ERIC-PCR不同于APPCR，它需要两个引物。尽管REP、ERIC和BOX序列因其在基因组中的高拷贝数和可变的间隔而互不相关，它们还是共同作为靶序列用于PCR指纹法。图15-10是一个ERIC指纹的例子。与限制片段长度多态性(RFLP)指纹法相比较，PCR指纹法简单而快速。
图15-9 AP-PCR图示
在这里单一的随机引物(682)从18个不同的细菌基因组产生独特的DNA指纹(1～18泳道)。泳道N为阴性对照。泳道M是一个123bp DNA大小梯度，其中每个连续的带增加123bp。(I．L．Pepper提供照片)
2.PCR的优点与不足之处
PCR有传统培养技术所没有的许多优点，比较灵敏并能检出所有的机体而不管其生理状态就是最显著特点。PCR试验一经在实验室优化，就能在24小时内相当快速简易地得到结果，相比之下，培养方法可能需要几天或几个星期。PCR也有一些不足之处，主要包括其同时检出有活力和无活力的机体。此外PCR易受抑制，这是样品中的腐殖物质和金属造成的。PCR也可能受到污染而造成假阳性结果。
图15-10 ERIC PCR实例
其中DNA指纹是从几个不同的细菌分离物产生的。I泳道是为123bp梯度(I．L．Pepper提供照片)
