蒽酮比色法测定可溶性糖含量

蒽酮比色法测定可溶性糖含量_生物化学实验指导

    实验九　蒽酮比色法测定可溶性糖含量

    【实验目的】

    1．掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。

    2．学习植物可溶性糖的提取方法。

    【实验原理】

    糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，因此可以用于糖的定量测定。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为620 nm，故在此波长下进行比色。

    该实验方法简便，但没有专一性，绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮反应，产生颜色。该方法灵敏度很高，糖含量在30μg左右就能进行测定，所以可作为微量测糖之用。一般在样品少的情况下，采用这一方法比较合适。

    【实验材料】

    任何植物鲜样或干样。

    【药品试剂】

    1．80%乙醇。

    2．葡萄糖标准溶液(100μg/ml):准确称取100 mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100 ml，使用时再稀释10倍(100μg/ml)。

    3．蒽酮试剂:称取1 g蒽酮，溶于80%浓硫酸(将98%浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中)1000 ml中，冷却至室温，储于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2～3周。

    【实验器材】

    分光光度计、分析天平、离心管、离心机、恒温水浴、试管、三角

    瓶、移液管(5 ml、1 ml、0．5 ml)、剪刀、瓷盘、玻棒、水浴锅、电炉、漏斗、滤纸。

    【实验方法】

    1．样品中可溶性糖的提取:称取剪碎混匀的新鲜样品0．5～1 g(或干样粉末5～100 mg)，放入大试管中，加入15 ml蒸馏水，在沸水浴中煮沸20分钟，取出冷却，过滤入100 ml容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。

    2．标准曲线制作:取6支大试管，从0～5分别编号，按表1-3加入各试剂。

    表1-3　　　　　　　　蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量

    

    将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮10分钟，取出冷却，在620 nm波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，葡萄糖含量(μg)为横坐标绘制标准曲线。

    3．样品测定:取待测样品提取液1 ml，加蒽酮试剂5 ml，同以上操作显色测定光密度。重复3次。4．结果计算

    可溶性糖含量(%)

    式中:

    C——从标准曲线查得葡萄糖量(μg)。

    V_T——样品提取液总体积(ml)。

    V₁——显色时取样品液量(ml)。

    W——样品重(g)。

    【注意事项】

    1．蒽酮试剂含有浓硫酸，使用时应小心。

    2．蒽酮要全部取自同一瓶，以保证条件一致性。

    3．该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应)，所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。

    4．不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。

    【思考题】

    1．运用蒽酮法测得的糖包括哪几类?

    2．制作标准曲线时应注意哪些问题?