测定酶活性是临床酶学分析中最常用的方法。根据酶促反应进程曲线,使酶促反应的初速度达到最大速度,即在过量底物存在下零级反应期的速度,此时反应速度与酶浓度之间是线性关系,从而进行酶活性测定。一种直接测定速度的方法称连续监测法,另一种在一定时间内通过测定总变化量计算速度的方法称定时法。酶促反应中底物浓度的检测见表4-2。
表4-2 酶促反应中底物浓度的检测
*国际临床化学联合会(IFCC)参考方法;#实际为拟胆碱酯酶(PCh E)
(一)定时法
这是早期测定酶活性的方法。大多是使酶作用一段时间,然后加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应,测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量,计算酶促反应平均速度。用此类方法测定酶活性,必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确,否则会引起较大误差。这种方法比较简单,因测定时酶促反应已被终止,故比色计或分光光度计无需保温设备,显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点是无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反应。
(二)连续监测法
连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据,求出酶反应初速度,间接计算酶活性的方法称为连续监测法,又称速率法。与定时法不同,这类方法无需停止酶促反应,不需添加其他呈色试剂就可测定反应物的变化,很容易观察反应的整个过程。这类测定方法简单,可将多点的测定结果连接成线,很容易找到成直线的区段,可观察是否偏离零级反应,因而可选择线性反应期计算酶活性,不需终止反应。连续监测法的测定结果常较定时法高,也较定时法准确。临床常用速率法测定谷丙转氨酶(GPT)活性。
谷丙转氨酶活性测定(速率法)
【原理】
在340nm处连续监测NADH的消耗量,计算出GPT的活性。
在GPT双试剂法测定中,首先使血清与缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合,37℃保温5min,将样品中所含的α-酮酸(如丙酮酸)消耗完,再加入α-酮戊二酸启动GPT催化的反应,在340nm处连续监测吸光度下降的速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-ΔA/min)的变化,计算GPT的活性。
【试剂】 为双试剂的组成和在反应液中的最终浓度,按此终浓度将各成分混合为单试剂。
1.试剂Ⅰ
Tris缓冲液 100mmol/L
L-丙氨酸 500mmol/L
NADH 0.18mmol/L
LDH 1200U/L
p H 7.3
2.试剂Ⅱ 15mmol/Lα-酮戊二酸。
3.待测患者血清或质控血清。
【操作】
1.手工操作法
(1)向光径1.0cm的石英比色皿中加入血清100μl,加试剂Ⅰ1000μl,混匀,(37±0.1)℃温育5min。
(2)加入试剂Ⅱ100μl,混匀,启动GPT催化的反应。
(3)在波长340nm处,延滞期30s,连续监测吸光度下降速率60s。根据线性反应期吸光度下降速率(-ΔA/min),计算出GPT活性。
2.自动生化分析仪操作程序的设置 按手工操作法设置,根据各实验室拥有的分析仪型号及操作说明书而设置。
【计算】
式中6220为NADH在340nm的摩尔吸光系数。
【参考区间】 5~40U/L。
【质量保证】
1.连续监测法测定酶活性时,要求使用的分光光度计,带宽≤6nm,比色杯光径1.0cm,具有(37±0.1)℃的恒温装置。试剂空白以蒸馏水代替血清,测定GPT活性应<5U/L。由于试剂空白读数来自工具酶中的杂酶及NADH自发氧化。报告结果应扣除每批试剂空白测定值。
2.血清不宜反复冷冻保存,以免影响酶活性。血清置4℃冰箱1周,酶活性无显著变化,不推荐冷冻保存GPT测定标本。草酸盐、肝素、枸橼酸盐等抗凝剂虽不抑制酶活性,但可引起反应液轻度浑浊。血液浑浊可影响测定结果或无法测定(如血脂过高、血清蛋白变质等)。红细胞内GPT活性为血清的3~5倍,应避免使用溶血标本。
3.GPT测定中存在两个副反应:①血清中存在的α-酮酸(如丙酮酸)能消耗NADH;②血清中谷氨酸脱氢酶(GLDH)增高时,在氨存在条件下,亦能消耗NADH。上述副反应都能消耗NADH,使340nm处吸光度下降值(-ΔA/min)增加,导致测定结果偏高。在双试剂法中,由于温育期长,能有效消除干扰反应,测定的准确性高,是测定GPT的首选方法。双试剂法还可适当降低试剂中的LDH用量。严重肝病患者血清谷氨酸脱氢酶活性和血氨增高,出现NH 4+的干扰,而一般血清中NH 4+含量甚微,其干扰反应不大。
4.在AACC(美国临床化学学会)或IFCC(国际临床化学学会)推荐的试剂盒中,含有磷酸吡哆醛(P-5′-P),而我国根据实际情况和习惯,国家卫生部临床检验中心推荐方法的试剂中不加P-5′-P。
【应用评价】
1.准确性好。由于测定上限在酶促反应的线性范围内,偏差小。
2.精确性好。测定条件较前面一直未提过的赖氏法易于控制,CV值比赖氏法小。
3.操作简便。标本测定中不需要标准对照,测定结果计算方便。
4.实验条件要求严格,成本高。
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