实验三十一 微生物基因组测序与序列组装
一、实验目的
（1）了解下一代测序技术的原理及其在微生物学研究中的应用。
（2）掌握基因组装软件Velvet的使用方法。
二、实验原理
第一代测序技术始于1975年Sanger的双脱氧链终止法，发展到现在，Sanger测序用四种不同的荧光染料分别标记片段末端不同的碱基，通过电泳将不同长度的片段分开，根据末端碱基得到原始序列信息。目前，Sanger测序可以测到800～1 000个碱基，但是测序通量很小，而且价格昂贵。2004—2005年间开始商业化使用的第二代测序技术（Next－Generation Sequencing）克服了以上两个缺点，它可以同时对多个DNA片段进行平行测序：将打碎后建库的DNA片段锚定在固体介质表面，比如通过连接接头的方法将DNA片段锚定在多个磁珠上进行PCR反应（Roche／454平台），或者锚定在测序通道内表面进行桥式PCR（Illumina平台）。通过对每个锚定DNA每加一个碱基进行一次“加上荧光染料—洗脱多余染料—荧光成像扫描”的循环过程，实现平行高通量的深度测序（图30－1）。目前常用的平台是Roche／454公司的FLX测序仪Illumina的HiSeq 2000测序仪和ABI的SOLiD测序平台。根据提供的DNA来源和前期处理的不同，二代测序技术可以用以解答不同研究目的的生物学问题，如可以用于微生物研究中的比较基因组学、转录组学、宏基因组学等。
本实验将学习使用Velvet软件组装Illumina／Solexa平台基因组测序结果。
Velvet软件主要有两个程序组成：velveth和velvetg。
（1）velveth的输入默认是fasta格式的序列文件，也能识别fastq、fasta．gz、fastq．gz、sam、bam、eland和gerald文件。序列类型默认是short，也可以是shortPaired、short2、shortPaired2、long或longPaired。
命令格式为：
＄．／velveth output＿directory hash＿length［［－file＿format］［－read＿type］filename］
图31－1 Illumina测序原理
velveth运行的结果生成一个hash表，并输出3个文件，其中Roadmaps和Sequences文件是下一步velvetg程序运行必需的。
Log：日志文件
Roadmaps：路线图文件
Sequences：序列文件，包含所有输入的序列
（2）velvetg是velvet的核心程序，其命令格式为：
＄．／velvetg output＿directory／［－cov＿cutoff］［－max＿coverage］…
运行的结果输出以下文件：
contigs．fa：fasta格式的组装好的片段，长度大于2k（k为velveth运行时用的字长）
PreGraph：中间组装图
LastGraph：最后组装图
Graph：最后组装图
stats．txt：统计信息
三、实验材料与仪器
（1）计算机（安装有Ubuntu Linux系统）。
（2）E．coli基因组测序原始序列文件，E．coli K12的基因组测序数据可以从下面网址下载：http：／／download．clcbio．com／testdata／raw＿data／solexa．zip。
四、实验步骤
（1）分离细菌E．coli单克隆，菌株在25mL LB中培养过夜，用于基因组DNA提取。
（2）基因组提取可以用细菌基因组提取试剂盒，如QIAGEN DNeasy Blood ＆Tissue Kit，DNA提取步骤参考试剂盒说明手册。
（3）紫外光谱检测提取的基因组DNA质量。一般基因组DNA样品（～20μg）在230nm与260nm有吸收峰，要求比值280／260＞1．8；并且比值260／230 ＞2。
（4）每菌株样品提交至少2μg基因组DNA用于高通量测序。目前测序公司常见用Illumina公司的HiSeq2000测序仪，可测两末端各100bp的数据。测序文库的构建流程及其他Illumina平台测序技术可以参考Illumina公司网站的说明：http：／／www．illumina．com／technology／sequencing＿technology．ilmn。
（5）测序数据的预处理。高通量测序的序列数据一般存储在FASTQ格式文件，文件后缀一般为．fastq，．fq等。FASTQ格式以每个测序读长（read）为4行，分别为头、序列、序列ID（可选）和质量分数（ASCII编码表示）。
（6）测序原始数据可以用FastQC评价质量好坏。FastQC可以从网址（http：／／www．bioinformatics．babraham．ac．uk／projects／fastqc／）下载。运行FastQC图形界面，打开FASTQ数据文件，就会以显示质量报告。检查per－base quality，persequence quality及per－base content等。其中overrepresentation of sequences可能是测序PCR假阳性（artifacts）。通过参考FastQC图标的颜色判断质量好坏（绿色代表正常；橙色代表可能有些问题；红色代表非常可能有问题）。但是也要注意测序中有些小的异常是可以接受的，并不会对后续数据分析造成影响。
（7）如果数据质量有问题，可以通过FASTX－Toolkit软件对数据文件进行处理，如一般要求测序数据的reads质量（－q）都为20以上：
＄fastq＿quality＿filter－Q33－q 20－p 80－i infile．fq－o outfile．fq
［－q N］代表只保留最小质量分数N以上。
［－p N］代表具有以上－q质量的碱基占的最小百分率。
其他命令可以参考网站说明http：／／hannonlab．cshl．edu／fastx＿toolkit。
（8）Velvet组装基因组。
①下载Velvet：http：／／www．ebi．ac．uk／～zerbino／velvet／。
②Velvet软件编译：
＄cd
＄mkdir assemble＿velvet
＄cp／home／bioinfo／Downloads／velvet＿1．2．10．tgz assemble＿velvet／
＄cd assemble＿velvet
＄tar zxvf velvet＿1．2．10．tgz＃解压
＄cd velvet＿1．2．10
＄make ＃编译
＄sudo apt－get install velvet ＃如果上面编译不成功可以用这条命令安装
③首先利用velvet自带的脚本程序对每一个pair－end数据进行合并：
＄shuffleSequences＿fastq．pl s1＿1．fq s1＿2．fq s1．fq
④运行velveth格式化reads：
＄velveth assembly＿all 23－fastq－shortPaired s1＿paired．fq－short s1＿1．fq－unique．outshort s1＿2．fq－unique．out
这里哈希长度（K－mer）为23，输入文件格式为fastq（－fastq），测序reads类型分别为配对的双末端序列（－shortPaired）与末配对的单端序列（－short）。
＊K－mer值必须为奇数，且小于MAXKMERLENGTH，这个值默认为31，test multiple K－mer values，and calculate the total number of contigs，N50，and N90for each assembly．
⑤运行velvetg组装序列：
＄velvetg assembly＿all－cov＿cutoff auto－exp＿cov auto－ins＿length500－ins＿length＿sd50
这里assembly＿all是工作目录
－ins＿length：双端测序reads中间插入片段的长度
－cov＿cutoff：过滤覆盖度域值，默认不移除
－exp＿cov：测序区域的期望覆盖率，auto为程序自动
－ins＿length＿sd：数据集的标准差，默认corresponding length的10%
上述组装命令运行后，会产生拼装得到的序列，为组装重叠群contigs，存储在工作目录下contigs．fa文件中。
⑥检查序列组装（assembly）结果：
＄count＿fasta．pl assembly＿all／contigs．fa
根据出来的N50和max contig长度来判断拼接的效果，contig数尽量小。可以改变选项和参数，得到最优结果。最后组装得到的Congtigs序列可以用于后续基因组分析与实验验证，如基因预测、比对基因组等。
五、实验报告
（1）运行环境（包括操作系统和软件），实验步骤，结果文件记录。
（2）上机实验中遇到的问题及其解决方法。
六、思考题
（1）下一代测序技术有哪些？其中Illumina平台的测序原理是什么？
（2）基因组组装的参数N50代表什么？
参考文献
［1］Metzker M L．Sequencing technologies—the next generation［J］．Nature Review of Genetics．2010，11（1）：31—46．
［2］Royce L，Boggess E，Jin T，et al．Identification of Mutations in Evolved Bacterial Genomes．In：Alper HS，editor．Systems Metabolic Engineering［M］．Humana Press，2013：249—267．
［3］秦楠，栗东芳，杨瑞馥．高通量测序技术及其在微生物学研究中的应用［J］．微生物学报，2011，51（4）：445—457．
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