项目十二 抗伪狂犬病病毒gG蛋白单克隆抗体的制备
一、项目背景
单克隆抗体是由可以制造这种抗体的免疫细胞与癌细胞融合后的细胞产生的，这种融合细胞既具有癌细胞不断分裂的能力，又具有免疫细胞产生抗体的能力。融合后的杂交细胞（杂交瘤）可以产生大量相同的抗体。由单克隆抗体做成的抗体药是目前治疗多种疾病的有效方法。单克隆抗体制备涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等方面的内容。
伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）又称猪疱疹病毒Ⅰ型、传染性延髓麻痹病毒、奇痒症病毒、奥叶兹基氏病病毒，是以引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒。由于本病的临床症状类似狂犬病，故用了“伪狂犬病”这一病名。在完成猪瘟净化的地区，伪狂犬病被认为是对经济影响最大的猪病毒病。家畜和野生哺乳动物（包括牛、绵羊、山羊、猫、狗和浣熊等）都是易感动物。这一疾病在这些宿主上通常是致命的。
抗伪狂犬病病毒单克隆抗体的制备在伪狂犬病病毒抗原分析、保护免疫及伪狂犬病诊断中起重要作用。
二、项目目标
（1）了解杂交瘤技术的基本原理；
（2）掌握实验动物免疫技术；
（3）掌握利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的方法；
（4）培养学生良好的实验习惯，以及实验观察、实验记录、实验分析的能力。
三、工作流程
流程一：工作准备
续表
流程二：动物免疫
（1）以大肠杆菌表达的猪伪狂犬病病毒（PRV）gG蛋白作为抗原，并精确定量。
（2）用戊巴比妥钠对2只8～12周龄的BALB／c纯系小鼠进行麻醉，按每克体重注射0.05g戊巴比妥钠的量对小鼠进行腹腔注射，5min后小鼠即进入昏迷状态。
（3）无菌条件下打开小鼠腹腔，暴露出脾脏，用1mL注射器将含有30nggG蛋白的抗原液0.1mL分别注射到两只小鼠脾脏内。
（4）将脾脏轻轻复位，缝合伤口，饲养备用。
（5）免疫3天后取脾细胞进行融合。
流程三：细胞悬液的制备
在杂交瘤技术中要使用三种细胞悬液：脾细胞悬液、SP2／0-Ag14骨髓瘤细胞悬液和腹腔巨噬细胞（用于饲养细胞）悬液。
（1）脾细胞悬液的制备。
取已免疫BALB／c小鼠，于免疫后第3天用眼球放血处死（收集流出血液制备阳性血清），用70%酒精浸泡5min后，无菌打开腹腔，取出脾脏，去除多余的脂肪组织，用37℃GKN液清洗2～3次。向脾内注射0.2mL GKN液（使脾脏膨胀以便于细胞散开）后，放入培养皿中，加入5mL GKN液，用L形6号针头将脾细胞轻轻挤出，用滴管吹打数次以使细胞散开成单细胞状态。
用不锈钢网将此细胞悬液过滤到50mL塑料离心管中，再加入10mL GKN液，混匀后，1000r／min离心5min，弃上清液，用10mL GKN液重新悬浮细胞，取0.1mL均匀细胞悬液进行活细胞计数，其余细胞悬液37℃下保存备用。
（2）SP2／0-Ag14骨髓瘤细胞悬液的制备。
将SP2／0-Ag14骨髓瘤细胞用RPMI1640完全培养液作增殖培养，每天传代一次，连续传代3天，使细胞在融合时达到对数生长期。取3～5瓶（50mL培养瓶）SP2／0-Ag14骨髓瘤细胞，倾去原来的培养上清液，每瓶加入37℃GKN液4mL，将细胞悬浮起来，收集各瓶中细胞液，放入50mL塑料离心管中，1000r／min离心5min（为省时可同脾细胞一同离心），弃去上清液，用10mL 37℃GKN液将细胞悬浮均匀，取0.1mL进行活细胞计数，其余悬液37℃下保存备用。
（3）腹腔巨噬细胞悬液的制备。
杂交瘤细胞开始生长时，需要有饲养细胞，一般用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。取12周龄BALB／c小鼠，拉颈处死，浸入70%酒精中消毒5min。在解剖盘中无菌打开腹部皮肤，暴露出腹膜，向腹腔中注入10mL RPMI1640完全培养液，按摩腹部1～2min后，用注射器抽出腹腔液（一般可抽出8～9mL），放入50mL塑料离心管中，37℃下保存备用。一般从一只小鼠取出的腹腔巨噬细胞可接种3～5块24孔或96孔培养板。可根据需要接种的培养板数来确定饲养细胞的量。
流程四：细胞融合及HAT筛选
（1）将已计数脾细胞和SP2／0-Ag14骨髓瘤细胞按6∶1的数量比例混合于50mL塑料离心管中，1000r／min离心5min。
（2）弃上清液，轻弹离心管底部，使沉淀细胞松散，40℃下预热1～2min。
（3）边摇边在45s内向已预热的离心管中匀速加入1mL 50%PEG溶液。
（4）立即边摇边在90s内向管内加速加入15mL 37℃GKN液，室温静置10min。
（5）1000r／min离心10min，弃上清液。
（6）向离心管中加入37℃的腹腔巨噬细胞悬液和40mL HAT培养液，悬浮均匀。
（7）将细胞悬液分种于两块24孔板（0.5mL／孔）和两块96孔板（0.2mL／孔）中，置于37℃5%CO2培养箱中培养。
（8）每天观察细胞的生长情况。
（9）于融合后第5天，用HAT培养液半量换液；于第10天用HT培养液半量换液；于第14天用HT培养液全量换液。
（10）当杂交瘤细胞长至孔底面积的1／2～2／3时，即可取培养上清液进行抗体检测。
流程五：抗体的检测
1.酶联免疫吸附法
（1）将gG蛋白用包被液稀释，使该病毒浓度为0.10μg／μL。
（2）将此浓度抗原液按每孔100μL的量分别加入40孔酶标板孔中，轻轻振荡，使液体覆盖孔底。
（3）把酶标板放4℃过夜（或37℃培养1～2h）进行包被。
（4）取出包被好的酶标板，倾去其中液体，用PBSS-Tween20缓冲液洗涤酶标板孔，每次洗3min，共洗3次。
（5）每孔加入含1%小牛血清白蛋白（BSA）的PBSS-Tween20缓冲液至孔满，室温下封闭30min。
（6）甩去封闭液，用PBSS-Tween20缓冲液洗3次，每次3min。
（7）每孔加入待测杂交瘤培养上清液100μL。留出4孔加入100μL阳性血清作为阳性对照，4孔加入100μL HT培养液作为阴性对照，4孔加入PBSS-Tween20缓冲液100μL作为空白对照。
（8）在37℃恒温水浴中培养60～90min。
（9）甩去待测上清液及对照液，用PBSS-Tween20缓冲液清洗5次，每次3min。
（10）每孔加入100μL 1∶500稀释的标有辣根过氧化物酶的羊（或兔）抗鼠IgG，37℃培养60min。
（11）甩去酶标二抗液，用PBSS-Tween20缓冲液清洗5次，每次3min。
（12）每孔加入100μL邻苯二胺底物反应液，室温下暗处反应30min。
（13）每孔加入1滴2mol／L H2SO4溶液以终止反应，用酶联免疫检测仪进行结果检测。呈现棕褐色反应者为阳性反应。检测出上清液为阳性的培养板孔即为阳性孔，可进行克隆化实验。
2.双相扩散法
（1）用含有0.01%NaN3和1%琼脂的磷酸盐缓冲液倒平板，每个9cm培养皿加18mL。
（2）用打孔器在倒好的琼脂平板上均匀打7个孔，中央一孔的孔径为4mm，周围6孔的孔径为6mm，中央孔与周围孔的间距为8～10mm。
（3）在中央孔加入待测的杂交瘤培养上清液至孔满，周围孔也分别加入羊（或兔）抗鼠二抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM的标准抗体制品至孔满。吸干待测孔中的液体后将培养皿倒置。
（4）40℃放置5～7h或37℃过夜。
（5）取出琼脂板观察结果，出现沉淀线可初步判定为免疫反应呈阳性，还可根据沉淀线的位置来确定所含抗体的类型。
（6）有阳性免疫反应的培养上清液原来所在的培养孔即为阳性孔，可进行克隆化实验。
流程六：克隆化
有限稀释法具有简便、快速且适于大规模操作等优点，因此在杂交瘤细胞的克隆化操作中常常使用这种方法。有限稀释法的具体操作如下。
（1）将阳性孔中的杂交瘤细胞吹打为均匀悬液，取0.1mL进行活细胞计数。
（2）用含有腹腔巨噬细胞的RPMI1640完全培养液对杂交瘤细胞进行梯度稀释，使其浓度分别为50个／mL、15个／mL、5个／mL。
（3）把三种稀释度的杂交瘤细胞悬液分种于三块96孔培养板孔中（0.2mL／孔）。
（4）置37℃50%CO2培养箱中培养。
（5）培养到第5天便可看到较小的细胞克隆，待单细胞克隆长至孔底面积的1／2～1／3时，再进行抗体检测。阳性孔中的单克隆杂交细胞即为阳性克隆，所分泌的抗体即为单克隆抗体。
四、工作注意事项
（1）合理设计实验，统筹安排好时间；
（2）整个制备过程须严格无菌，以确保后续实验能顺利进行；
（3）尽量提高抗原免疫用抗原的纯度，并保持其活性。同样浓度的抗原，若含有较多的杂质，会明显影响抗体的产生，并为杂交瘤细胞分泌抗体的筛选带来麻烦，获得所需的分泌特异抗体的杂交瘤细胞的概率也小；
（4）免疫小鼠时，一次同时免疫几只，以免小鼠中途死亡；
（5）不同抗原的免疫方法不同，除常规免疫方法外，近年来还建立了脾内免疫法及体外细胞免疫法。脾内免疫是将抗原直接注入小鼠的脾脏，具有抗原用量小及免疫周期短的优点；体外细胞免疫是将抗原加入体外培养的淋巴细胞中，使之形成免疫细胞。
五、思考题
（1）制备单克隆抗体的技术要点是什么？
（2）影响杂交瘤技术的因素有哪些？
（3）单克隆抗体的制备流程是什么？
