′核酶分析

    

    在5′核酶分析（5′nuclease assay）或Applied Biosystems公司TaqMan R技术中采用了均质液相反应，利用Taq聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性在PCR扩增过程中产生报告荧光信号来辨别等位基因型。

    在一个PCR体系中，除了扩增引物外，还包含一对位于扩增引物之间的TaqMan探针，探针序列设计为分别与野生型和变异型互补，每一种独特的探针优先结合一种等位基因，探针与非靶序列的结合被大大弱化甚至完全消除。在TaqMan探针的5'末端标记有报告荧光染料，如FAM等；在探针序列的3'末端标记有淬灭染料，如TAMRA等。由于探针序列很短，两个基团空间位置很近，构成荧光能量传递的关系，没有荧光信号产生。在PCR扩增时，引物模板退火，探针可与多态性模板杂交结合，在随后的延伸反应中，当引物延伸合成至探针与模板结合处，Taq聚合酶的5'-外切酶活性降解探针的5'-报告荧光基团，使之与淬灭基团分离，释放荧光信号。通过在探针中标记不同的报告荧光染料，使得等位基因型能够被准确判别（图2-4）。

    

图2-4　5′-核酶分析（Taqman ?R）

    另一种利用杂交技术进行SNP分型方法是采用波长飘移的分子灯塔探针，这是一种带有茎环结构的分子探针。在未结合到目标序列的游离状态下，茎环结构使荧光基团靠近淬灭基团，荧光信号无法产生。当探针与目标序列退火结合，茎环结构被打开，荧光基团与淬灭基团分离，荧光信号被释放。在扩增过程中荧光信号强度与被扩增的模板量成正比，且能够被实时或至少在PCR之后就被检测出来（图2-5）。

    由于对探针的荧光和猝灭特性进行修饰的需要较高成本，这种TaqMan技术更适合在大量样本中分析有限数量的SNP。TaqMan检测可以在96孔或384孔板中进行。由于探针掺入和荧光信号检测在PCR扩增过程中同步进行，避免了PCR扩增后的检测过程，因此TaqMan技术具有低错误率和用户界面友好的优点。此外，对仪器装备的投资比质谱相对要低。

    

图2-5　分子灯塔技术

    TaqMan技术的精确性高度依赖于杂交条件，影响因素包括缓冲条件或引物浓度，因此探针设计和检测体系优化费时费力。目前，许多供应商可以应客户需求提供探针设计和检测验证，从而使得TaqMan技术成为日常工作中能够运用的高通量分型的手段。